构建口服硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)–雷公藤红素(celastrol, CEL)超分子纳米组装体跨越肠屏障干预非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)

《Materials Today Bio》：Engineering Oral Celastrol-Polysaccharide Supramolecular Nanoassemblies Across Intestinal Barriers for the Intervention of Nonalcoholic Steatohepatitis

　　

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的有效口服疗法开发仍是临床亟待满足的需求。雷公藤红素(celastrol, CEL)因其调脂、抗炎及抗氧化特性是NASH的潜力候选药物，但其临床转化受限于口服生物利用度低及治疗窗窄（源于显著毒性）。为克服上述局限，研究人员设计并制备了经天然多糖自组装稳定化的新型无载体CEL纳米粒。该制剂策略旨在显著提高CEL口服生物利用度，从而增强其NASH治疗效果并降低相关不良反应。本研究构建了含42种不同纳米组装体的多糖–CEL超分子库用于NASH口服递送筛选，确定硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)为最优多糖辅料。所得CS/CEL纳米组装体(CS/CNA)明显改善口服吸收，与游离CEL相比基于AUC(0-t)计算的全身暴露量提高3.12倍。基于抑制剂的机制研究表明CS/CNA穿越肠上皮细胞可能涉及多种内吞途径及部分溶酶体逃逸。在NASH小鼠模型中，CS/CNA通过调节肝脏炎症和减少脂质沉积显示出强效治疗效果。关键的是，该纳米组装体安全性良好，可减轻游离CEL相关毒性。此策略在增效的同时降低毒副作用，有效拓宽了雷公藤红素的治疗窗。本研究确立CS/CNA为具前景的NASH口服治疗候选物，并为推进CEL治疗NASH的临床转化提供了稳健平台。

本文发表于《Materials Today Bio》。

研究背景与目的

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)进展的关键阶段，可发展为肝硬化及肝癌，现有疗法存在局限且多为注射给药，患者依从性差。雷公藤红素(celastrol, CEL)提取自雷公藤(Tripterygium wilfordii)根皮，具调脂、抗炎及保肝活性，但水溶性差、口服生物利用度极低且有剂量依赖性毒性，严重阻碍其临床转化。天然多糖具良好生物相容性，可通过氢键等与CEL形成超分子自组装纳米粒(supramolecular nanoassemblies)，改善溶解性、延长肠道滞留、调节粒径并促进细胞摄取，同时减少CEL直接与机体接触以降低毒性。本研究旨在通过筛选多种天然多糖与CEL的自组装纳米体系，获得最优口服纳米制剂以干预NASH。

主要关键技术方法

研究人员选取壳聚糖(chitosan)、黄芪多糖(astragalus polysaccharide)、葡聚糖(dextran)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)、褐藻糖(fucoidan)、人参多糖(ginseng polysaccharide)及海藻酸钠(sodium alginate)共7种代表性天然多糖，按不同质量比与CEL构建含42种纳米组装体的筛选库；通过动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)及分子动力学模拟(MD simulations)表征CS/CEL纳米组装体(CS/CNA)理化性质与相互作用；采用体外模拟胃液(SGF)/肠液(SIF)评估稳定性与释放行为；通过荧光标记示踪小鼠体内分布与肠道滞留，以SD大鼠进行口服药代动力学(pharmacokinetics, PK)研究；借助Caco-2单层模型(Transwell)及内吞抑制剂探究跨膜转运机制；以高脂缺胆碱蛋氨酸饮食(high-fat methionine- and choline-deficient diet, HFMCD)诱导C57BL/6小鼠NASH模型评价药效，并设置7天及30天重复给药毒性实验评估生物相容性。

研究结果

3.1. Screening and physicochemical characterization of polysaccharide-CEL nano-assemblies

通过对42种多糖–CEL纳米组装体的粒径、多分散指数(PDI)、ζ电位及TEM形貌系统表征，并结合体外溶血实验评估血液相容性，筛选出CS与CEL形成的CS/CNA呈均匀球形、粒径小且分布均一、PDI低、ζ电位适中(-10至-20 mV)、无明显聚集且溶血率低，综合理化性质与生物相容性最优，确定为后续研究对象。

3.2. Structure and Oral Absorption Potential of CS/CNA

XRD显示CEL晶体峰在CS/CNA中消失，表明CEL转为无定形态或分子分散态；CEL:CS质量比1:100时包封率(encapsulation efficiency, EE%)=83.914±2.052%，载药量(drug loading efficiency, DLE%)=17.463±0.120%；25℃下粒径与PDI 7天内稳定。MD模拟显示CEL与CS通过氢键及疏水作用紧密聚集；FTIR与破坏实验证实氢键和疏水相互作用参与自组装。CS/CNA在SGF与SIF中药物释放率低、FRET效应稳定、粒径与形貌基本不变，在pH 1.2–7.2及不同离子强度下胶体稳定，提示胃肠道环境中可保持纳米结构完整性，利于小肠吸收。

3.3. CS/CNA improves oral absorption and preferential hepatic accumulation after oral administration

活体成像与离体组织荧光定量显示，Cy5标记的CS/CNA在小鼠肠道滞留时间更长、空肠蓄积增加，且口服后肝脏荧光强度高于游离Cy5组，提示改善吸收并倾向肝富集。SD大鼠药代实验表明CS/CNA的AUC_(0-t)为17.92 mg·h/L，是游离CEL(5.74 mg·h/L)的3.12倍；C_max由0.305 mg/L升至1.403 mg/L，T_max由1.560 h缩短至0.278 h，证实CS/CNA显著提升CEL口服生物利用度。

3.4. Mechanisms of CS/CNA Cellular Uptake

Caco-2单层模型显示CS/CNA透过率显著高于游离Cy5且跨上皮电阻(TEER)与紧密连接蛋白ZO-1无变化，排除细胞旁路途径，提示经转细胞途径摄取。4℃及内吞抑制剂实验表明摄取为能量依赖过程，主要涉及网格蛋白介导内吞(clathrin-mediated endocytosis, 抑制率47.29%)与巨胞饮(macropinocytosis, 抑制率61.91%)，小窝蛋白介导内吞(caveolae-mediated endocytosis)贡献较小。胞内运输研究显示内质网(ER)/高尔基体(Golgi)-相关运输、高尔基体-细胞膜运输及微管相关途径参与外排，Bafilomycin A1不影响外排提示部分溶酶体逃逸，共定位分析见CS/CNA与溶酶体、ER及高尔基体部分共定位。

3.5. CS/CNA exhibits favorable biocompatibility in vitro and in vivo

CCK-8显示CS/CNA处理24 h后Caco-2与HepG2细胞存活率>85%，而同浓度游离CEL显著降低HepG2活力。小鼠连续7天高剂量(20 mg/kg CEL当量)游离CEL致体重下降、血清ALT/AST/UREA/CK升高及肝脾病理损伤；同等剂量CS/CNA未见明显异常。30天重复给药(4、10、20 mg/kg CEL当量)各组均无死亡、行为异常或体重明显下降，脏器系数、血常规、血清生化及主要器官H&E染色均未见治疗相关病理改变，表明CS/CNA具良好急/重复给药安全性。

3.6. Dose-gradient evaluation and therapeutic efficacy of CS/CNA in Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH) mice

剂量梯度实验显示10 mg/kg CEL当量(中剂量)CS/CNA在改善血清肝损指标、肝外观、肝体比、脂肪变、纤维化及脂质沉积方面效果较优。在HFMCD诱导NASH模型中，第4–8周每日给予中剂量CS/CNA或阳性药resmetirom(10 mg/kg)，与HFMCD组及游离CEL组比，CS/CNA显著降低血清ALT、AST及总胆固醇(TC)；改善葡萄糖耐量(GTT)与胰岛素敏感性(ITT)；减轻肝肿大，改善肝色泽；H&E、Masson、天狼猩红(Sirius Red)及油红O(Oil Red O)染色显示脂肪变性、气球样变、炎性浸润及胶原沉积减少；Western blot显示肝组织TNF-α、IL-6及α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)表达下调，疗效与resmetirom相当。

讨论与结论

研究人员讨论指出，CS因使CS/CNA具备适宜纳米尺寸、低PDI、适度负电及良好血液相容性而被选为最优多糖辅料。XRD证实CEL在CS/CNA中由晶态转为无定形态有助于胃肠分散及吸收提升；在SGF/SIF中结构稳定利于完整纳米粒跨肠上皮转运。Caco-2模型提示CS/CNA经能量依赖的网格蛋白介导内吞与巨胞饮入胞，并经ER/Golgi相关途径转运及部分溶酶体逃逸实现跨膜转运，但抑制剂实验存在局限性，仅提示可能通路。CS/CNA通过提高CEL全身暴露并降低其直接细胞毒性拓宽治疗窗，在NASH模型中改善肝损、糖耐量、脂肪变、炎症及纤维化，与resmetirom相当。作者也指出局限性：MD模拟用CS四糖简化模型无法完全代表天然CS复杂性；肝脏富集未能区分被动首过与受体介导过程；未直接行黏液扩散或黏蛋白结合实验；荧光成像为半定量，需LC-MS/MS进行组织药代定量；制剂放大、批次重现性及长期稳定性待进一步研究。结论为：本研究提出天然多糖引导的超分子纳米组装策略改善难溶性药物CEL口服递送。CS/CNA提高CEL口服吸收及全身暴露、降低CEL相关毒性，在HFMCD诱导NASH小鼠中展现良好治疗效果，为开发更安全有效的CEL口服制剂干预NASH提供了有前景的平台。