应用交联质谱(crosslinking mass spectrometry, XL-MS)研究ATP合酶(ATP synthase, Complex V)与三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)之间的关系

《Nature Communications》：Investigating the relationship between ATP synthase and the TCA cycle by crosslinking mass spectrometry

　　

线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)由多亚基蛋白复合物组成，其与三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)协同产生ATP。尽管二者存在代谢偶联，通常认为仅复合物II(complex II, 琥珀酸脱氢酶succinate dehydrogenase)是OXPHOS与TCA cycle之间的直接结构桥梁。本研究联合应用溶液内交联质谱(in-solution crosslinking mass-spectrometry, XL-MS)、定量蛋白质组学(quantitative proteomics)、复合体谱分析(complexome profiling)及蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native PAGE, BN-PAGE)，探讨生理及病理条件下ATP合酶(complex V)在线粒体代谢网络中的定位。研究人员发现，小鼠野生型心脏中ATP合酶的F1催化头与TCA cycle酶形成广泛接触，确立了OXPHOS与中心碳代谢之间此前未被认识的空间联系。进一步发现，缺失线粒体RNA稳定蛋白LRPPRC(Leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing protein, LRPPRC)——其破坏小鼠心脏mtDNA基因表达——导致ATP合酶不稳定及F1–TCA cycle相互作用增强。此外，ATP合酶功能缺陷促进ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1, ATIF1/IF1)通过其N端抑制区结合F1头，使ATP合酶转向能量保存状态。综上，研究结果表明mtDNA基因表达受损导致ATP合酶二级重塑及其互作网络重构，揭示了线粒体适应生物能应激的可能机制。

论文解读：ATP合酶与三羧酸循环空间互作及其在LRPPRC缺失条件下的重塑

研究背景与立题依据

线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统由呼吸链复合物I–IV及ATP合酶(complex V, F_oF₁-ATP synthase)组成，嵌入线粒体内膜(inner mitochondrial membrane, IMM)，负责利用质子驱动力(proton-motive force, Δp)合成ATP。三羧酸循环(TCA cycle)位于基质，为呼吸链提供还原当量。传统观点认为仅有复合物II(succinate dehydrogenase, SDH)同时作为TCA cycle酶和OXPHOS组分，构成两系统间唯一的直接结构桥接。TCA cycle酶可形成代谢物通道(metabolon)以提高底物通道效率，但此类瞬时弱相互作用难以用常规生化方法捕获。已有文献提示OXPHOS复合物间存在超复合物(respirasomes)，ATP合酶F_o域二聚化参与嵴(cristae)膜弯曲，但其与TCA cycle有无超出复合物II的物理联系尚不清楚。LRPPRC是结合mtDNA编码mRNA并促进其多腺苷酸化及翻译的稳定蛋白，心脏特异性Lrpprc敲除小鼠因mtDNA编码亚基(如ATP6)缺失致ATP合酶组装缺陷及功能障碍，是探究ATP合酶不稳定后互作网络变化的理想模型。本研究发表于《Nature Communications》，旨在用原位交联质谱等技术揭示ATP合酶与TCA cycle的空间互作关系及病理状态下的重塑规律。

主要关键技术方法

研究人员取野生型(wild-type, WT)及心脏骨骼肌特异性Lrpprc、Tfam、Rnaseh1敲除(knockout, KO)小鼠心脏，分离完整线粒体；进行溶液内0.5 mM DSSO(disuccinimidyl sulfoxide)交联；分别开展：(1) 无标记定量bottom-up蛋白质组学；(2) BN-PAGE分离复合体后胶条酶解进行复合体谱分析(complexome profiling, DIA模式LC-MS/MS)；(3) XL-MS(DSSO交联肽段经SCX分馏，Orbitrap检测，XlinkX搜库，MaxQuant定量，FDR<5%)；(4) BN-PAGE及荧光Western blot双色共检测ATPA(α亚基)与MDHM(线粒体苹果酸脱氢酶mitochondrial malate dehydrogenase 2, MDH2)等；(5) 胶内ATP酶活性染色。XL-MS数据经MS1强度中位归一化及差异丰度分析，复合体谱按胶条切片累加各结构域信号。

研究结果

Mitochondrial ATP synthase associates with the TCA cycle enzymes in the mouse heart（小鼠心脏线粒体ATP合酶与TCA cycle酶相关联）

重新分析已发表WT小鼠心脏线粒体XL-MS数据集，发现所有OXPHOS复合物中ATP合酶与TCA cycle酶交联最多，交联主要涉及F₁催化头α(ATPA/ATP5A)和β(ATPB/ATP5B)亚基，对象包括柠檬酸合酶(citrate synthase, CS/CSY)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A, IDHP)、α-酮戊二酸脱氢酶复合体亚基(ODPA, ODO1/2)、琥珀酰CoA连接酶(SUCA, SUCB1)、延胡索酸水合酶(fumarate hydratase, FUMH)及苹果酸脱氢酶(MDHM/MDH2)。结论：生理状态下ATP合酶F₁头与多种TCA cycle酶存在原位空间接近/互作，是除复合物II外OXPHOS–TCA的新结构联系。

Knockout of Lrpprc in the mouse heart perturbs the integrity of the Fo portion of ATP synthase（小鼠心脏Lrpprc敲除扰乱ATP合酶F_o域完整性）

Bottom-up蛋白质组显示Lrpprc KO中线粒体编码ATP6显著下调，核编码F_o亚基(ATP5I/e, ATP5L/g)及外周柄亚基(ATP5H/b', AT5F1/OSCP外围)上调，F₁亚基量不变。复合体谱显示KO中线粒体ATP合酶二聚体(V₂)、寡聚体(V_x)减少，完整单体(V)保留，并在~325–390 kDa出现F₁头亚组装体积累，F_o与外周柄信号分离。结论：LRPPRC缺失致mtDNA编码F_o亚基缺乏，破坏ATP合酶F_o域稳定性，引起F₁头部分解离积累。

Increased interactions between the partially released F1 domain of ATP synthase and metabolic enzymes in the Lrpprc knockout heart mitochondria（Lrpprc敲除心脏线粒体中部分释放的ATP合酶F₁域与代谢酶相互作用增强）

XL-MS定量显示KO中线粒体ATP合酶–TCA cycle酶交联谱总强度约翻倍(CSM从226增至344)，且主要富集于F₁(ATPA, ATPB, ATP5E)与TCA酶(ACON, IDHP, MDHM)及脂肪酸β氧化(ACOT2, ACADM/L)、酮体代谢(SCOT1/OXCT1)酶之间；相关蛋白丰度无变化排除表达量干扰。BN-PAGE双色免疫印迹示KO中低分子量F₁亚组装与MDHM共迁移且MDHM条带扩散，验证物理结合增强。同法检测Tfam及Rnaseh1 KO心脏亦见F₁–MDHM共迁移。结论：ATP合酶F₁头与TCA cycle等代谢酶互作增强是mtDNA表达缺陷致ATP合酶不稳定后的普遍现象。

LRPPRC loss induces ATIF1-mediated regulatory remodeling at the catalytic F1 domain of ATP synthase（LRPPRC缺失诱导ATIF1介导的ATP合酶催化F₁域调控重塑）

XL-MS检测到KO中线粒体ATIF1(IF₁)与F₁亚基(ATPA, ATPB, ATPG/ATP5C1)交联剧增，ATIF1分子内交联从全长(N端抑制区+ C端二聚化区)转为集中C端二聚化区，表明ATIF1从高阶寡聚体解离为活性二聚体，N端抑制区游离并结合F₁。复合体谱示KO中游离ATIF1减少，ATIF1峰向F₁亚组装切片偏移。结论：ATP合酶F₁头解离时ATIF1被招募并以N端抑制区结合F₁，抑制反向ATP水解，使酶进入能量保存模式。

Structural reorganization of ATP synthase in the Lrpprc knockout hearts（Lrpprc敲除心脏中ATP合酶的结构重组）

ATP合酶内部交联分析：F₁域内交联无变；F_o亚基ATP5I–ATP5L自身/相互交联增强(伴蛋白上调)；F_o亚基ATP8与外周柄ATP5J(d/b)交联增强，而F₁亚基ATPB与外周柄ATP5J交联减弱。结论：ATP6缺乏削弱F₁–外周柄偶联、强化F_o–外周柄作用及F_o亚基间代偿互作，促成F₁部分脱离及F₁亚组装体积累。

讨论与结论翻译总结

线粒体ATP合酶不仅是OXPHOS催化及嵴架构组件，还作为动态枢纽连接生物能学与中心碳代谢。生理条件下其F₁催化头与多种TCA cycle酶形成广泛接触，建立了超越复合物II的OXPHOS–TCA cycle结构关联且该互作在牛及人细胞中保守。当mtDNA基因表达受损(Lrpprc、Tfam、Rnaseh1 KO)，ATP6下调致F_o域不稳定，引发F₁部分解离、F₁–TCA cycle/β氧化/酮体代谢酶互作增强，伴随ATIF1从失活寡聚体解离为二聚体并结合F₁N端抑制区以阻遏ATP水解，F_o域亚基代偿上调加固残存二聚。此互作网络重塑可能是呼吸链受限时代谢适应的表现。该发现拓展了对ATP合酶在代谢网络中地位的认识，并为线粒体病(ATP合酶缺陷、mtDNA表达异常相关心肌病及脑肌病)的机制研究提供新视角。未来需明确这些互作的功能代谢后果及可否作为干预靶点。