运动皮层直接兴奋网状部黑质(substantia nigra pars reticulata, SNr)——基底神经节输出核团

　　

摘要：网状部黑质(substantia nigra pars reticulata, SNr)中的抑制性神经元是基底神经节调节行为的主要输出通道。研究人员利用病毒靶向光遗传学(virally targeted optogenetic)方法结合SNr神经元全细胞膜片钳记录发现，小鼠初级运动皮层(primary motor cortex, M1)和次级运动皮层(secondary motor cortex, M2)的投射神经元与不同亚群的GABA能SNr神经元形成单突触兴奋性连接。此外，光刺激这些皮层轴突末梢可显著提高SNr神经元放电频率。为探究皮层向SNr输入的空间组织，研究人员采用跨突触病毒标记法鉴定接受M1或M2单突触输入的SNr神经元，发现M1与M2投射在SNr内呈拓扑分布。化学遗传抑制接受M1或M2输入的SNr神经元引起自发行相反向变化。上述结果揭示了运动皮层可直接调节基底神经节向下游靶区输出的功能通路。

论文解读：《Nature Communications》——Motor cortex directly excites the substantia nigra pars reticulata, the basal ganglia output nucleus》

一、研究背景与意义

基底神经节(basal ganglia)通过一系列皮层—纹状体—苍白球—丘脑环路参与运动选择与强化学习，其最终输出主要由位于腹侧中脑的网状部黑质(substantia nigra pars reticulata, SNr)——即基底神经节最大的输出核团——承担。GABA能SNr神经元具自发紧张性放电，通过持续抑制下游中脑与脑干靶区调控行为输出。经典模型认为SNr主要受上游基底神经节核团（纹状体striatum、外侧苍白球globus pallidus pars externa, GPe、底丘脑核subthalamic nucleus, STN）的输入调控，构成直接通路(direct pathway)、间接通路(indirect pathway)及超直接通路(hyperdirect pathway, cortex-STN-SNr)。解剖学提示运动皮层（M1、M2）轴突末梢可到达黑质区域，但运动皮层是否与GABA能SNr神经元形成功能性单突触连接及其生理与行为意义长期未明。本研究旨在明确M1/M2→SNr是否存在谷氨酸能单突触兴奋、其突触性质、空间拓扑关系及对自发行为的功能影响。

二、主要关键技术方法

研究人员使用C57BL/6J野生型及Parvalbumin-Cre(PV-Cre)小鼠，经立体定位注射腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)，结合离体急性脑切片全细胞patch clamp（电流钳与电压钳模式）及473 nm光刺激Channelrhodopsin-2(ChR2)标记轴突末梢，验证单突触性(TTX+4-AP法)与谷氨酸受体介导性质(NBQX/D-APV阻断)；采用AAV1顺行跨突触传递表达Cre/Flpo并配合FLEX/fDIO系统标记接受M1或M2单突触输入的SNr神经元，进行三维胞体定位与拓扑分析；利用PV-Cre小鼠与AAV1-Flpo及Con/Fon-hM4Di(DREADD Gi)病毒交叉策略，特异性抑制接受M1-或M2-输入的PV阳性SNr神经元，经CNO(clozapine-N-oxide)腹腔给药后在旷场(open field)中用DeepLabCut及Keypoint-MoSeq量化自发行走、静止等行为参数。

三、研究结果

Monosynaptic excitation of GABAergic SNr neurons by M1 projections（M1投射对GABA能SNr神经元的单突触兴奋）

在M1注射AAV2-CaMKIIα-ChR2-eYFP后，离体脑片记录显示光刺激M1轴突末梢可在约53%的GABA能SNr神经元诱发兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential, EPSP)，被TTX消除而经4-AP(4-aminopyridine)恢复证实为单突触；被AMPA受体拮抗剂NBQX与NMDA受体拮抗剂D-APV(D-2-amino-5-phosphonovalerate)阻断，确认是谷氨酸能AMPA受体主导的突触。响应与未响应神经元电生理特征存在差异（膜电容、sag ratio、动作电位半宽），提示M1选择性靶向特定SNr亚群。

Monosynaptic excitation of GABAergic SNr neurons by M2 projections（M2投射对GABA能SNr神经元的单突触兴奋）

同样方法用于M2注射，约52% GABA能SNr神经元产生EPSP，亦为单突触谷氨酸能。M1-响应与M2-响应SNr神经元在自发放电率（M1-recipient更高）及动作电位阈值（M1-recipient更低）上有显著差异，提示二者属不同SNr亚群。

Pre- and postsynaptic selectivity of corticonigral projections（皮质黑质投射的突触前与突触后选择性）

多巴胺能SNr神经元极少响应M1/M2光刺激；初级体感皮层(primary somatosensory cortex, S1)注射未见SNr轴突及反应，表明皮质—SNr投射具区域特异性，主要限于运动皮层且主要作用于GABA能而非多巴胺能SNr神经元。

Cortical input to SNr neurons is mediated by AMPA receptors（皮质向SNr神经元的输入由AMPA受体介导）

电压钳下记录到兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current, EPSC)，M1-evoked EPSC幅值大于M2-evoked；配对脉冲比(paired pulse ratio, PPR)多数<1示短时程压抑(short-term depression)；在?70 mV与+40 mV对比及Mg²⁺去除条件下确认NMDA成分极弱，突触传递以AMPA受体为主，并具钙通透AMPA(calcium-permeable AMPA, CP-AMPA)受体内向整流特征。

Photostimulation of motor cortex axon terminals increases SNr firing rate ex vivo（离体光刺激运动皮层轴突末梢提高SNr放电率）

Cell-attached模式下20 Hz光刺激M1或M2轴突末梢引起SNr神经元时间锁定性放电增加，冠状与矢状切片结果一致，排除多突触中介，证实皮层直接驱动SNr紧张性放电。

M1 and M2 corticonigral terminals are topographically organized（M1与M2皮质黑质终末呈拓扑分布）

双色荧光标记显示M1轴突集中在SNr中央核区，M2轴突分布于腹内侧及包绕SNr腹侧边界，在后2/3 AP轴最明显，符合Deniau等提出SNr板层分区。

M1- and M2-recipient SNr neurons are topographically organized（M1-与M2-接受SNr神经元呈拓扑分布）

AAV1跨突触标记显示M1-recipient SNr神经元位于SNr中心区，M2-recipient位于内侧及腹侧边界，两群体极少重叠（<1.4%），证实M1/M2分别支配不同且不重叠的SNr GABA能神经元亚群。

Functional role of M1- and M2-recipient SNr populations（M1-与M2-接受SNr神经元群体的功能作用）

化学遗传抑制PV+ M1-recipient SNr神经元降低旷场总位移、减少移动时间及行走起始次数，增加静止行为；抑制PV+ M2-recipient SNr神经元则增加总位移、移动时间及行走启动。表明M1-targeted与M2-targeted SNr输出回路对自发运动有相反调节作用。

四、讨论与结论总结（翻译浓缩）

研究人员证明M1与M2的谷氨酸能投射神经元与GABA能SNr神经元形成功能性单突触连接，该连接主要经AMPA受体介导并能直接提升SNr神经元放电率。M1-SNr与M2-SNr通路在电生理特性、SNr内拓扑位置（M1→中央核，M2→腹内侧）及所支配SNr亚群上彼此分离，极少汇聚于同一SNr神经元，且化学遗传抑制分别引起运动减少与运动增加，说明皮质黑质投射按功能模块平行组织。此直接皮质—SNr通路可绕过纹状体等上游核团，使皮层指令以高时间精度直达基底节输出级，可能与超直接通路共同贡献SNr早期兴奋反应。M1-recipient SNr可能参与精细肢端运动协调，M2-recipient SNr涉及整体运动启动/抑制。综上，本研究揭示运动皮层可通过单突触兴奋性连接直接调制基底神经节输出核团SNr的活动，拓展了对基底节信息流及皮层—皮下运动控制回路的传统认识。

发表于《Nature Communications》