转移性骨髓神经母细胞瘤样本单细胞与整体RNA测序数据的比较研究

《Cells》：Comparative Study of Single-Cell and Bulk RNA Sequencing Data from Metastatic Bone Marrow Neuroblastoma Samples

　　

神经母细胞瘤以骨髓（BM）作为细胞播散与扩散部位的高频受累为特征。本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析初诊时采集的一部分转移性BM样本的细胞异质性。通过与整体RNA测序（bulk RNA sequencing）数据比较，研究进一步细化了分析结果。研究记录到相对于健康对照，调节性T细胞（Treg）富集，并且CD24、CD47和CD200“别吃我”信号被激活。计算分析强调了神经母细胞瘤细胞与髓系细胞之间经由淀粉样前体蛋白（APP）和中期因子（MK）信号网络的通讯。在神经母细胞瘤细胞内部，鉴定出互斥的肾上腺能（adrenergic）与过渡性（transitory）细胞状态，并划分出10个亚簇。此外，研究还考察了共有及特异性的肿瘤细胞抗原。CNTFR和CHRNA3作为高优先级候选分子获得验证，证实其对神经母细胞瘤细胞具有较强选择性。综上，这些发现支持骨髓生态系统存在显著的肿瘤依赖性调控，在引入免疫治疗时应予以考虑。此外，这些结果凸显了在单细胞分辨率下探索新抗原的潜力。

本文发表于《Cells》，聚焦高危神经母细胞瘤骨髓（BM）转移灶的细胞组成、肿瘤异质性、免疫抑制生态及潜在靶抗原。研究背景在于：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤之一，初诊时超过半数患者已发生转移，其中骨与骨髓是最主要播散部位。尽管近年来ALK抑制剂、抗GD2单克隆抗体、干细胞移植以及嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）等策略推动了高危患者治疗进展，但复发难治病例预后仍差。既往关于原发灶的单细胞转录组研究已表明神经母细胞瘤具有显著细胞可塑性与转录异质性，但对骨髓转移微环境的系统研究相对不足。尤其是，肿瘤细胞如何重塑骨髓生态、诱导免疫抑制状态、维持转移灶存活并影响免疫治疗敏感性，仍缺少单细胞层面的解析。因此，开展针对骨髓转移神经母细胞瘤的单细胞研究，既有助于揭示转移灶的细胞组成和通讯网络，也有助于筛选更具特异性的免疫治疗靶点。

研究人员围绕初诊、未经治疗的高危神经母细胞瘤骨髓转移样本开展分析，目标包括：描绘肿瘤及非恶性细胞群体组成；识别肿瘤细胞与骨髓免疫细胞间的优势通讯轴；解析肿瘤细胞内部状态和亚群异质性；在单细胞分辨率下筛选肿瘤相关表面抗原（TSA）。研究表明，转移性骨髓并非单纯被肿瘤细胞占据，而是形成了由肿瘤主导调控的免疫抑制性生态位。该生态位中，调节性T细胞（Treg）显著富集，髓系成分增加，且肿瘤细胞高表达CD24、CD47、CD200等免疫逃逸相关表面分子。与此同时，神经母细胞瘤细胞主要作为信号发送者，经由APP和MK通路与单核细胞、树突细胞及T细胞发生功能性联系。研究还证实，骨髓转移灶中的肿瘤细胞具有明显异质性，存在互斥的肾上腺能与过渡性状态，并进一步分化为10个转录亚簇。重要的是，研究人员通过单细胞与整体RNA测序交叉验证，提出并验证了CNTFR、CHRNA3等较高选择性的候选表面抗原，为后续免疫治疗靶点开发提供依据。

在主要技术方法方面，研究使用4例高危神经母细胞瘤初诊骨髓转移患者及1例儿童健康供者骨髓样本，基于BD Rhapsody?平台开展scRNA-seq；通过SingleR进行细胞注释，结合推断拷贝数变异（CNV）与神经母细胞瘤特征基因集界定恶性细胞；采用CellChat重建配体-受体通讯网络，利用Seurat进行肿瘤细胞聚类与差异表达分析；通过多参数流式细胞术（MFC）、免疫荧光和骨髓活检免疫组织化学进行验证；并纳入GEO数据库GSE94035队列，对骨髓播散肿瘤细胞（DTC）、骨髓单个核细胞（MNC）及原发肿瘤细胞（TU）的bulk RNA-seq数据进行交叉验证。

在结果部分，论文首先以“Single-Cell Transcriptome Profiling of the Metastatic Neuroblastoma BM Niche”为题，构建了4例转移性骨髓样本与1例健康骨髓样本的单细胞图谱。研究共整合42,531个细胞，识别出B细胞、树突细胞、红系细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（NK）、造血干/祖细胞（SC）、T细胞和神经母细胞瘤细胞8类主要群体。通过经典标志基因和CNV推断，恶性细胞身份得到进一步确认。比较不同样本显示，肿瘤浸润较高的骨髓中单核细胞和NK细胞比例升高；与健康骨髓相比，转移样本还呈现M1样与M2样巨噬细胞增加，提示髓系重塑在转移骨髓生态中具有重要地位。

在“Neuroblastoma Cells Act as Signaling Senders in the Metastatic BM Niche”部分，研究人员利用CellChat分析主要细胞群之间的配体-受体互作。结果显示，转移性骨髓内存在广泛细胞通讯，神经母细胞瘤细胞主要充当信号发送者，单核细胞则是最主要的信号接收者。神经母细胞瘤细胞与B细胞、树突细胞、单核细胞之间存在偏好性交流，其中APP和MK信号通路最为突出，另有THBS1相关网络参与细胞外基质（ECM）重塑和炎症微环境维持。这说明骨髓转移灶中肿瘤细胞并非被动存在，而是主动塑造微环境。

在“The MK Signaling Pathway Is Favored by Neuroblastoma Cells”部分，论文进一步解析关键通讯轴。结果提示，神经母细胞瘤细胞优先通过MDK–NCL、MDK–LRP1、MDK–ITGA6+ITGB1、MDK–ITGA4+ITGB1等互作建立通讯；树突细胞与肿瘤细胞之间则突出APP–CD74信号；单核细胞与肿瘤细胞之间则体现THBS1–CD36轴。与健康骨髓以CXCL12–CXCR4为主的稳态通讯不同，转移性骨髓明显偏向MK相关网络，提示MK通路是神经母细胞瘤驱动骨髓微环境重编程的重要节点。

在“Immunosuppressive Surface Markers Are Enriched in Metastatic Neuroblastoma Cells”部分，研究通过扩展队列的MFC验证转移灶中肿瘤细胞表面分子谱。结果显示，CD45^?/CD56^high神经母细胞瘤细胞高表达CD24、CD9、CD44、CD146、CD47、CD200、CD151和CD90等分子，尤其CD24、CD47和CD200表达稳定，支持其参与“别吃我”信号和免疫抑制微环境建立。这部分结果从蛋白层面补强了单细胞数据关于免疫逃逸的判断。

在“Metastatic BM Is Enriched in Treg Cells”部分，研究聚焦Treg。基于单细胞数据，Treg被界定为CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127⁺FOXP3⁺细胞，其在转移骨髓中的相对频率约为健康对照的5倍。随后，独立队列的MFC及额外病例的骨髓活检双重染色进一步证实，转移骨髓内FOXP3⁺ T细胞明显增多。进一步计算分析发现，神经母细胞瘤细胞与非Treg T细胞更偏向APP–CD74通讯，而与Treg则更偏向MDK–NCL通讯，提示MK轴可能也参与Treg相关免疫抑制网络的维持。

在“Single-Cell Analysis Confirms the Heterogeneity of Neuroblastoma Cells Retrieved from the BM Metastatic Niche”部分，研究系统解析骨髓转移灶肿瘤细胞状态。结果显示，多数肿瘤细胞转录特征接近胎儿肾上腺髓质中的neuroblasts和cycling neuroblasts，仅少数类似bridge或chromaffin细胞。进一步以既往定义的特征集比对后发现，骨髓转移灶肿瘤细胞主要形成互斥的肾上腺能（ADR）和过渡性（TRANS）状态，而未检测到间充质（MES）肿瘤特征，MES信号反而位于非恶性基质细胞。细胞周期分析显示，多数肿瘤细胞位于G₁期，少部分位于S期或G₂/M期；并未清晰识别PROM1、SOX2、ALDHA1定义的静息癌症干细胞群。进一步聚类后，研究鉴定出10个肿瘤亚簇，不同亚簇呈现不同细胞周期偏向、标志基因表达谱和富集通路，如异染色质形成、视黄类结合、TGF-β信号、染色体凝缩调控、细胞饥饿反应以及NF-κB信号等，提示骨髓转移灶内部存在复杂的功能分层与转录可塑性。

在“The BM Metastatic Neuroblastoma Cell Surface Signature Can Be Defined at the Single-Cell Resolution”部分，研究人员基于恶性与非恶性细胞差异表达分析并结合细胞表面蛋白数据库，筛选出29个TSA。这些分子既包括所有肿瘤亚簇共有的抗原，也包括个别亚簇特异抗原。共有TSA包括CNTFR、CHRNA3、L1CAM、NCAM1、CADM1、EFNB3、FGFR1、NRCAM、SEZ6L2等，而THSD7A、PTGER3、MCAM等则限于特定亚簇。随后，研究选择较少被表征的CNTFR与CHRNA3进行验证。免疫荧光与流式结果证实，两者在多种神经母细胞瘤细胞系膜表面表达明显，而在基质细胞及其他肿瘤类型细胞中表达极低或缺失，说明其具有较高肿瘤选择性。

在“Bulk RNA-Seq Data Summarizing the Results Obtained at the Single-Cell Level”部分，研究利用GSE94035的86份样本进行体外数据交叉验证。结果显示，单细胞筛出的29个TSA中有24个可在bulk RNA-seq差异基因中得到支持，这24个TSA可有效区分骨髓播散肿瘤细胞/原发肿瘤细胞与骨髓单个核细胞。CNTFR和CHRNA3同样在DTC和TU中高表达，而在MNC中表达微弱。该24基因特征既能在单细胞数据中准确标注神经母细胞瘤细胞，也几乎不干扰健康骨髓中的正常细胞群，进一步增强了其作为免疫治疗候选靶标的可信度。

讨论部分指出，本研究从单细胞层面证明了骨髓转移神经母细胞瘤兼具显著肿瘤内异质性与免疫抑制性微环境。10个肿瘤亚簇虽部分转录重叠，但仍维持不同功能程序，反映出在低突变负荷背景下，转录与表观层面的多样性可能是驱动肿瘤进展和耐药的重要机制。与此同时，肿瘤细胞通过APP、MK及THBS1等网络主导与骨髓免疫细胞的互作，并伴随CD24、CD47、CD200等免疫逃逸分子表达，以及Treg和抑制性髓系成分富集，共同塑造不利于抗肿瘤免疫的生态位。研究还强调，单细胞转录组学能够更精准地筛选转移灶特异抗原，所提出的TSA谱，尤其是CNTFR、CHRNA3及CD276等分子，为双靶点CAR-T等组合免疫治疗策略提供了候选基础。

研究结论部分可译为：总体而言，本研究增进了对骨髓转移性神经母细胞瘤中细胞异质性、肿瘤–免疫互作及免疫抑制机制的理解，这些认识可为未来靶向治疗提供依据。通过系统列举多种肿瘤相关表面抗原并在多类细胞中验证其表达，研究为拓展免疫治疗应用提供了基础，并支持开发双重靶向策略以克服所观察到的免疫逃逸机制。未来，将功能验证研究与免疫谱分析相结合，对于推动这些发现向临床可操作的免疫治疗转化至关重要。