小鼠不同品系和性别中硝酸甘油（GTN）与降钙素基因相关肽（CGRP）诱发偏头痛样行为的系统比较

《Behavioural Brain Research》：Systematic comparison of GTN- and CGRP-induced migraine-like behaviors across sex and strain in mice

　　

临床前偏头痛研究依赖多种实验诱发的行为学检测，但不同研究在实验条件上存在显著异质性，阻碍了结果之间的直接比较。此外，较小的效应量常需较大的样本量，这不仅降低了药理学筛选的可行性，也与3R原则（替代、减少、优化）相冲突。研究人员开展了系统且并行的研究，对两种广泛使用的偏头痛诱发剂——硝酸甘油（GTN）和降钙素基因相关肽（CGRP）——在小鼠不同性别和品系中的作用进行了比较。研究人员将雄性及雌性CD-1和C57BL/6J小鼠用于评估三种常用的偏头痛相关性状检测指标：眶周机械性痛觉过敏（PMA）、避光行为及小鼠痛觉表情评分。所有行为学检测均在同一动物中按标准化流程依次进行，且效应量被设定为足够大，以便在中等样本量下即可检出，并保持药理学反转的可行性。研究结果显示，GTN和CGRP产生了部分重叠但依赖于检测方法、品系和性别的行为学特征。尽管两种诱发剂均能可靠诱导PMA，但其在避光行为和痛觉表情评分上的效应在不同品系和性别间存在差异。该研究为在控制实验条件下偏头痛样行为终点的并行评估提供了参考，强调了诱发剂选择、品系、性别和行为学检测方法对结果的关键影响，支持采用标准化的多终点方法来开展旨在药理学筛选的临床前偏头痛研究，从而在最大化信息获取量的同时遵守3R原则。

偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，以反复发作的头痛及包括皮肤痛觉过敏、畏光及自发性疼痛在内的多种感觉和情感症状为特征。临床前模型在深化对偏头痛病理生理机制的理解及推动新型治疗策略开发方面发挥了重要作用，然而这些模型的转化价值高度依赖于所采用行为学检测指标的稳健性和可重复性。在啮齿类动物中，最常用的偏头痛诱发剂包括硝酸甘油（GTN）和降钙素基因相关肽（CGRP），但直接比较这两种模型的研究较少，且各研究在小鼠品系、性别、行为学检测方法及实验时间等方面差异显著，使得跨研究比较困难甚至产生误导。此外，诱发性指标如机械性痛觉过敏常被作为主要终点，而非诱发性或半自发性指标如避光行为和面部痛觉表情评分正越来越多地被纳入以更好地捕捉偏头痛相关性状。然而，这些检测往往单独应用、在不同队列中进行，或针对检测极小效应量而优化条件，导致需要大量动物数量，且所获得表型难以被药理学方法逆转，限制了其在药物筛选中的实用性。开展此项研究旨在解决上述局限，通过标准化的实验条件对诱发剂在不同性别和品系中的作用进行系统、并行的比较，并选择足够稳健的效应量以便在中等样本量下检出且适合药理学调控，同时通过在同一实验序列中结合多种行为学终点以最大化每只动物的信息获取量，从而遵守3R原则。该论文发表在《Behavioural Brain Research》。

研究人员为开展此项研究采用了以下主要关键技术方法：实验动物为来自意大利费拉拉大学动物设施的雄性及雌性C57BL/6J和CD-1小鼠（2-4月龄），在特定无病原体条件下饲养。小鼠在实验前接受结构化的适应性训练（包括光暗箱和透明圆筒内的适应），实验当日于注射前获取基线面部录像和PMA基线数据，随后腹腔注射CGRP（0.1 mg/kg）、GTN（10 mg/kg）或溶媒对照；注射后10分钟进行光暗箱测试（30分钟）以评估避光行为，注射后60分钟再次录制面部录像并进行PMA检测。PMA采用von Frey纤维丝以上下法评估眶周区域机械性痛觉过敏；避光行为通过记录小鼠在光照强度为3000 lux的光暗箱中明亮隔室的停留时间进行评估；痛觉表情评分依据小鼠痛觉表情量表（Mouse Grimace Scale），由盲法观察者对眼眶紧缩、鼻bulge及耳位置三个Action Unit进行0-2分评分。统计学分析采用GraphPad Prism软件，PMA和痛觉表情评分使用重复测量三因素方差分析（时间作为被试内因素，处理和性别为被试间因素，按品系分别分析），避光行为采用三因素方差分析，事后比较采用?ídák多重比较检验。

研究结果部分按行为学指标分述如下：

**眶周机械性痛觉过敏（PMA）**：在C57BL/6J小鼠中，三因素重复测量方差分析显示处理、时间的主效应显著，存在显著的处理×时间交互作用及处理×性别×时间交互作用。事后分析证实GTN和CGRP均显著降低了两性小鼠的机械性痛阈值；GTN诱导的PMA在雌性中显著强于雄性，而CGRP诱导的PMA则无性别差异。在CD-1小鼠中，处理和时间的效应显著，存在处理×时间交互作用，但未检测到与性别相关的交互作用。事后分析显示CGRP显著降低了两性小鼠的机械阈值；GTN效应较为有限，仅在雄性中观察到相较于溶媒对照组的显著阈值降低，雌性中未达显著性。

**避光行为**：三因素方差分析显示处理、品系和性别的效应显著，且存在处理×性别交互作用。然而事后多重比较未能揭示处理组与相应溶媒对照组之间的显著差异。总体表明避光行为受品系和性别等生物学变量影响，而诱发剂的效应较小且在不同实验条件下不一致。

**痛觉表情评分**：在C57BL/6J小鼠中，处理和时间的效应显著，存在处理×时间交互作用。事后分析显示CGRP显著升高了雄性小鼠的痛觉表情评分，雌性仅呈增高趋势未达显著；GTN未能在任一生别中显著改变评分。在CD-1小鼠中，处理和时间的效应显著，处理×时间交互作用显著。事后分析表明CGRP显著升高了两性评分，GTN仅在雌性中显著升高评分。作为敏感性分析，Wilcoxon配对符号秩检验显示C57BL/6J雌性CGRP处理组的评分显著增加，该结论在参数检验中未达显著。Spearman相关分析显示PMA与其他行为终点无显著关联，但痛觉表情评分与避光行为存在弱负相关；按诱发剂分组分层分析显示，该关联主要由CGRP处理组驱动。

讨论部分：研究人员指出，通过在同一动物中依次评估诱发性和非诱发性偏头痛样行为，旨在减少动物数量同时最大化信息产出。溶媒对照动物在各行为检测中未显示基线与注射后时间点的变化，表明顺序检测程序本身未引入可检测的残留效应。研究证实GTN和CGRP产生部分重叠但非等同的行为表型，结果高度依赖于所选终点、小鼠品系和性别。PMA是最稳健一致的指标，而避光行为和痛觉表情评分显示出更强的情境敏感性，并揭示了诱发剂、品系和性别依赖的差异效应。这些发现凸显了在临床前偏头痛研究中进行系统模型比较和终点选择的重要性，特别是在药理学筛选背景下。直接比较方面，既往GTN和CGRP研究多单独开展，使用不同品系、条件和检测方法，且常在单一性别中进行或合并性别分析，导致结果异质性高、难以整合。本研究通过协调实验条件、纳入两种常用品系和双性别、采用规定的诱发性和非诱发性检测指标，为理性选择临床前偏头痛模型提供了实践指导。PMA作为最稳定的终点，其效应量受品系和性别调节，GTN较CGRP对生物学变异源更为敏感；C57BL/6J小鼠的PMA反应强于CD-1小鼠，雌性较雄性更为敏感。避光行为则更为多变且情境依赖，GTN未能诱导可检测的畏光样表现，CGRP仅在雄性C57BL/6J小鼠中呈降低趋势但未达显著，表明该指标敏感性较低、泛化性差，不宜单独作为核心表型但可视为补充性终点，且需注意一般运动活动、焦虑样行为或镇静效应的潜在混杂。痛觉表情评分显示了与上述指标不同的诱发剂和性别依赖性敏感模式：CGRP在多数组群中升高评分，GTN效应更局限仅见于CD-1雌性；品系差异明显，CD-1小鼠反应更强，可能与该指标最初在远交CD-1小鼠中开发验证有关。从方法学角度，痛觉表情评分可与PMA便捷整合，作为不增加动物数量的非诱发性补充指标。

研究结论：GTN和CGRP诱发部分重叠但非等同的偏头痛样行为表型，其检测结果受行为终点、小鼠品系和性别的强烈影响。PMA是最稳健一致的读出指标，而避光行为和痛觉表情评分则显示出更高的情境敏感性。该研究支持在临床前偏头痛研究中采用标准化的多终点方法，以在最大化信息获取的同时遵守3R原则，并为旨在药理学评价的实验设计和解读提供方法学参考。