通过纳米颗粒递送的RNA干扰技术沉默细胞色素p450还原酶基因，可提高斜纹夜蛾对λ-氯氰菊酯的敏感性

《Crop Protection》：Silencing cytochrome p450 reductase gene via nanoparticle-delivered RNA interference increases λ-cyhalothrin susceptibility in Spodoptera frugiperda

　　徐志恒|徐伟环|李晓杰|沈洪进|范小培|朱梦瑶|阿米尔·汗·科拉伊|贾米拉·法蒂玛|胡祖庆|李永强中国陕西省杨凌市西北农林科技大学植保学院，作物抗逆与高效生产国家重点实验室，教育部植物保护资源与害虫管理重点实验室，邮编712100摘要草地贪夜蛾是一种具有全球性扩散趋势的鳞翅目害虫，会给农业带来严重损失，且对传统杀虫剂越来越具有抗性。RNA干扰技术为害虫防治提供了一种可持续的替代方案。本研究在草地贪夜蛾中发现了NADPH-细胞色素P450还原酶基因（CPR），该基因是细胞色素P450依赖性外源物质代谢过程中的关键基因，可作为新的RNA干扰靶标。克隆得到的SfCPR基因具有CPR家族典型的结构特征，表达分析显示其在幼虫后期、脂肪体及中肠中的表达水平最高。注射0.9和1.8微克的双链SfCPR后，72小时内基因表达分别降低了39.8%和55.5%。抑制SfCPR表达后，幼虫对λ-氯氰菊酯的敏感性增加，最大死亡率上升了26.7%，而直接口服裸露的双链RNA则未表现出明显效果。将双链RNA包裹在壳聚糖结合的三聚磷酸钠纳米颗粒中，可避免其降解，且相比裸露的双链SfCPR，更能提高沉默效率。注射1.0微克的CS-TPP-双链SfCPR后，72小时内SfCPR表达下降了50.5%至56.7%，幼虫死亡率上升了40%，这一数值远高于仅口服裸露双链RNA组20%的死亡率提升幅度。此外，口服CS-TPP-封装的SfCPR纳米颗粒还能增加昆虫对杀虫剂的敏感性，延缓化蛹过程，减少成虫出现率，表明该纳米颗粒能够有效引发系统性的RNA干扰。本研究展示了CS-TPP-双链SfCPR纳米颗粒在通过RNA干扰实现可持续害虫控制、应对杀虫剂抗性方面的应用潜力。1. 引言草地贪夜蛾属于夜蛾科，是一种极具破坏性的害虫，对玉米、水稻和高粱等禾本科作物的全球生产构成严重威胁（Overton等人，2021；Tay等人，2023）。该物种原产于美洲的热带和亚热带地区，后来迅速扩散，2016年侵入非洲，2019年进入亚洲（Kenis等人，2023）。其强大的入侵能力源于多种生物特性，包括高多食性、高繁殖力、较强的迁徙能力以及没有滞育现象（Jing等人，2021）。此外，草地贪夜蛾还对多种类别的杀虫剂产生了抗性，包括有机磷类、拟除虫菊酯类、二酰胺类，以及斯皮诺沙德这类微生物杀虫剂（Boaventura等人，2020；Gutiérrez-Moreno等人，2019；Okuma等人，2018；Tay等人，2023；Van den Berg和du Plessis，2022；Zhao等人，2020）。杀虫剂抗性的普遍出现，凸显出亟需寻找环境友好的替代策略来控制草地贪夜蛾种群。RNA干扰技术因其特异性和环境安全性，被视为害虫防治的理想方法。该技术通过同源双链RNA诱导目标基因的转录后沉默（Hannon，2002；Zhu和Palli，2020）。已有多个表达双链RNA的转基因作物成功控制了多种害虫，比如表达dsVATPase A基因的转基因玉米可抵抗棉铃虫（Baum等人，2007），表达dsCYP6AE14基因的转基因棉花可抵抗斜纹夜蛾（Mao等人，2007），表达dsβ-Actin基因的转基因番茄可抵抗红蜘蛛（Wu等人，2023）。除了转基因技术，基于RNA干扰的生物杀虫剂也在不断研发中（Kebede和Fite，2022；Silver等人，2021；Wang等人，2025b）。在草地贪夜蛾中，通过双链RNA沉默相关神经肽基因可降低产卵率（Griebler等人，2008），抑制几丁质酶基因则能干扰幼虫蜕皮过程（Liu等人，2022）。下调肠道受体基因可改变草地贪夜蛾和斜纹夜蛾幼虫对Cry1AcF毒素的敏感性（Dutta等人，2023）。此外，通过口服方式抑制Tuta absoluta的几丁质脱乙酰酶8基因表达，可显著降低幼虫存活率和化蛹率，使其对苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂的敏感性上升（Zhao等人，2026）。尽管取得了这些进展，但不同昆虫类群中RNA干扰的效率存在差异，一般来说鞘翅目昆虫的RNA干扰效率高于鳞翅目昆虫（Shukla等人，2016；Wang等人，2016）。有研究指出，RNA干扰效率主要与昆虫体内双链RNA的稳定性有关（Fan等人，2022）。例如在鳞翅目昆虫中，低RNA干扰效率主要是由于肠道和血淋巴中的核酸酶会快速降解双链RNA（Cooper等人，2020；Guan等人，2018；Zhou等人，2024）。这些局限性表明，有必要开发有效的递送系统，既能保护双链RNA免受酶解，又能促进其进入昆虫细胞。纳米技术为解决这些问题提供了可能方案（da Silva等人，2024；Qiao等人，2024；Quilez-Molina等人，2024；Yan等人，2021）。已有多种纳米材料被用作双链RNA的载体，包括壳聚糖（CS）（Gurusamy等人，2020a；Liu等人，2025a、2025b）、脂质体（Dhandapani等人，2022；Gurusamy等人，2020b）、星形聚阳离子（SPc）（Chao等人，2023；Sun等人，2020；Wang等人，2023）、层状双氢氧化物纳米颗粒（LDH）（Cheng等人，2024），以及介孔有机硅纳米颗粒（MON-NH2）（Hu等人，2025）。研究表明，纳米颗粒能够保护双链RNA免受RNase的降解，同时帮助其进入昆虫细胞（Wang等人，2023；Yan等人，2021）。例如，携带针对RdRp基因的壳聚糖双链RNA可抑制草地贪夜蛾9细胞株中的虾病毒感染（Theerawanitchpan等人，2012），而通过壳聚糖递送针对几丁质酶10基因的双链RNA，则能提高迁徙蝗虫的RNA干扰效率（Liu等人，2025b）。类似地，基于脂质体的、针对硫氧还蛋白还原酶基因的双链RNA可抑制蜜蜂体内的 Nosema ceranae 病原体生长（Qi等人，2024）。此外，在温室试验中，喷施负载有发夹形RNA的星形聚阳离子纳米颗粒，也对桃蚜具有杀虫活性（Ma等人，2023）。层状双氢氧化物纳米颗粒可增强双链RNA在刺吸式害虫肠道表面的附着性，提高其在肠道内的稳定性（Cheng等人，2024）。另外，基于硅材料的介孔有机硅纳米颗粒也能显著提高鳞翅目苹果蠹蛾和半翅目棉铃虫对杀虫剂的敏感性（Hu等人，2025；Shi等人，2025）。在这些材料中，壳聚糖作为一种可从天然几丁质脱乙酰化得到的可生物降解、生物相容性的多糖，展现出极大的应用潜力，也是应用最广泛的天然生物聚合物之一（Gurusamy等人，2020a；Liu等人，2025b；Yang等人，2022）。壳聚糖可通过其带正电的胺基团（–NH3+）与双链RNA上带负电的磷酸基团（PO43?）之间的离子相互作用，形成稳定的聚电解质复合物，从而结合双链RNA。这种阳离子包封作用可以通过纳米级的物理屏障阻止核酸酶接近，进而保护双链RNA免受RNase的降解（Quilez-Molina等人，2024）。已有研究表明，基于壳聚糖的纳米颗粒能够提高双链RNA的稳定性及其在昆虫细胞内的摄取效率，从而在不同昆虫类群中实现高效的RNA干扰，这些昆虫包括茶尺蠖、家蚕、迁徙蝗虫、Piezodorus guildinii虫以及Tuta absoluta蛾（Sun等人，2020；Liu等人，2025a；Liu等人，2025b；Schvartzman等人，2025；Wang等人，2023）。值得注意的是，经三聚磷酸钠离子交联的壳聚糖，其包封效率、稳定性和生物分布能力都会进一步提升（Dhandapani等人，2019；Liu和Gao，2009）。与未经修饰的壳聚糖相比，与三聚磷酸钠结合的壳聚糖在多种昆虫物种中都展现出更强的保护作用和更高的沉默效率（Dhandapani等人，2019；Quilez-Molina等人，2024；Ragelle等人，2014）。例如，向埃及伊蚊幼虫口服递送CS-TPP-双链IAP纳米颗粒可导致超过60%的死亡率，而仅使用壳聚糖包裹的双链IAP纳米颗粒时，死亡率仅为35%（Dhandapani等人，2019）。在果蝇中，CS-TPP包裹的双链E75纳米颗粒的尺寸更小，多分散指数也更低，这会导致睾丸发育异常，其生育率也远低于直接口服裸露的双链E75颗粒的情况（Li等人，2024a）。令人瞩目的是，在鳞翅目昆虫中，口服CS-TPP包裹的双链RNA可有效下调脂肪酶和几丁质酶基因的表达，从而降低这些酶的活性，显著减少斜纹夜蛾的化蛹率和成虫出现率（Kolge等人，2023）。更有研究显示，口服CS-TPP包裹的、针对钙激活钾通道基因的双链RNA，可提高草地贪夜蛾对杀虫剂的敏感性，还会干扰其生长发育（Li等人，2026）。这些研究都证明了CS-TPP纳米颗粒作为稳定和递送双链RNA用于害虫控制的载体，具有很大的应用前景。过去几十年来，化学杀虫剂在全球范围内被广泛用于控制草地贪夜蛾。然而，这种害虫已经对多种主要类别的杀虫剂产生了不同程度的抗性（Kenis等人，2023；Kulye等人，2021；Tay等人，2023）。昆虫产生抗性的主要原因有两个：一是目标位点对杀虫剂的敏感度下降，二是解毒酶的活性升高。在这些解毒酶中，细胞色素P450单加氧酶在代谢抗性中起着至关重要的作用。这类酶能够催化外源毒素的单加氧反应，已有研究表明多种昆虫物种的抗性都与这类酶有关，比如烟粉虱的CYP6CM1基因（Karunker等人，2008）、斜纹夜蛾的CYP337B3基因（Joussen等人，2012）、冈比亚按蚊的CYP4G16基因（Balabanidou等人，2016）、荨麻叶螨的CYP392A16基因（Riga等人，2014），以及小菜蛾的CYP6AE70基因（Hu等人，2024）。特别的是，最近的研究发现草地贪夜蛾中有两种细胞色素P450基因CYP9A32和CYP6B50的表达量上升，而这些基因与杀虫剂抗性有关（Guo等人，2025；Lin等人，2025）。此外，还有多项研究将细胞色素P450基因认定为草地贪夜蛾的潜在解毒酶（Cui等人，2020；Lu等人，2024；Shi等人，2023）。作为细胞色素P450单加氧酶系统的关键组成部分，NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR，EC 1.6.2.4）是一种属于黄素蛋白家族的膜结合蛋白（Feyereisen，1999）。CPR包含保守的黄素单核苷酸结构域、黄素腺嘌呤二核苷酸结构域以及NADPH结合结构域（Wang等人，1997）。它在将电子从NADPH传递给细胞色素P450酶类过程中起着关键作用，因此是P450依赖性反应中不可或缺的成分（Murataliev和Feyereisen，2000）。鉴于CPR在这些催化反应中的核心作用，抑制其功能有望降低细胞色素P450酶类的活性。事实上，已有研究证明，通过RNA干扰沉默CPR基因可降低多种昆虫物种的杀虫剂耐受性。比如，在斜纹夜蛾中沉默CPR基因可降低其对福美司和印毒杀的耐受性（Ji等人，2019；Shi等人，2021），而在迁徙蝗虫中则能提高其对卡巴利特的敏感性（Zhang等人，2017）。在褐飞虱中，沉默CPR基因可增加其对溴氰菊酯和吡虫啉的敏感性（Liu等人，2015），而在豌豆蚜中，则可降低其对氯吡硫磷、吡虫啉和溴氰菊酯的耐受性（Qiao等人，2022）。与这些研究结果一致，我们近期的研究也发现，抑制TCPR基因的表达可显著提高Tuta absoluta蛾对λ-氯氰菊酯的敏感性，同时减轻叶片损伤（Li等人，2024b）。另外，有研究指出CPR可能与斜纹夜蛾对印毒杀的抗性，以及Bradysia odoriphaga对新烟碱类杀虫剂的抗性有关（Wang等人，2025a）。所有这些研究都表明，CPR是用于通过RNA干扰策略应对杀虫剂抗性的重要靶标。为了解决杀虫剂抗性这一难题，本研究旨在：（1）鉴定草地贪夜蛾的CPR基因；（2）利用实时定量PCR技术分析该基因的时空表达模式；（3）通过口服和显微注射两种方式检测RNA干扰效应，并研究其对λ-氯氰菊酯毒性的协同影响；（4）通过动态光散射和透射电子显微镜技术合成并表征CS-TPP-双链SfCPR纳米颗粒；（5）评估纳米颗粒递送系统的RNA干扰效率，以及其对昆虫生长发育和杀虫剂敏感性的影响。本研究充分体现了CS-TPP-双链SfCPR纳米颗粒作为RNA干扰驱动的生物杀虫剂，在有效控制草地贪夜蛾抗性方面的巨大潜力。2. 材料与方法2.1 昆虫培育本研究中使用的草地贪夜蛾最初是从玉米田中采集的，随后在24孔板中以人工饲料进行培育。培育条件为温度27±2℃，相对湿度60±10%，光照周期为14:10小时（明暗比），具体条件与先前研究一致（Xu等人，2025）。2.2 SfCPR基因的克隆与序列分析采用SV Total RNA Isolation System Kit（Promega公司，美国麦迪逊市）提取总RNA。第一链cDNA的合成则使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit（Thermo Fisher Scientific公司，美国）完成。引物是通过Primer 3 Plus（https://www.primer3plus.com/）根据预测的S. frugiperda NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）序列（XM_035580124.2）设计的；引物序列列于表1中。按照我们之前的方法（Li等人，2020年），扩增出开放阅读框（ORF），并通过凝胶纯化得到产物。将纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体（Promega，美国麦迪逊市）中，然后转入大肠杆菌JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选试验。从重组克隆中分离出质粒，并通过测序加以确认。使用GeneDoc（https://www.softpedia.com/get/Science-CAD/GeneDoc.shtml）进行多序列比对。利用Compute pI/Mw工具（https://web.expasy.org/compute_pi/）估算编码蛋白的理论分子量及等电点。表1. 用于目标基因克隆、双链RNA合成以及mRNA表达分析的引物。引物核苷酸序列（5′-3′）长度（bp）产物大小（bp）CPR-F1CCGGTTGTAAAGTCCTCTCGA212226CPR-R1GTCTACAGGTTCACAAATTCGCC23dsSfCPR-F2 ataatacgactcactatagggCGGAGATGATGACGCTAACA40475dsSfCPR-R2 ataatacgactcactatagggGAAAGGATGCTTTTTGCTGC40qPCR-CPR-F3CCTCCACTGGACCACTTGTG20210qPCR-CPR-R3TACACGAGGAAGAGGCTTGC20引物中的T7 RNA聚合酶启动子序列为小写形式。2.3 表达谱分析的样本采集为了对SfCPR的表达进行时空定位分析，我们按照既定流程（Xu等人，2025年），从五龄幼虫中收集了9个发育阶段（卵、六个龄期幼虫、蛹、成虫）以及7种不同组织（头部、表皮、马氏管、脂肪体、前肠、中肠和后肠），每类各取三份生物学重复样本。样本在液氮中快速冷冻后储存在-70℃下。使用RNAiso Easy试剂盒（Takara，中国大连）提取RNA。每个样本约1μg的RNA用于结合含DNase的RT混合物（US Everbright，中国苏州）进行cDNA合成。2.4 定量实时PCR（RT-qPCR）使用CFX Connect实时检测系统（Bio-Rad，美国赫拉克勒斯市）以及2×SYBR Green qPCR Master Mix（US Everbright，中国苏州），按照先前的方法（Li等人，2026年）测定SfCPR的表达水平。引物是通过Primer3Plus设计的。GAPDH和Actin 3α作为双重参考基因。在使用前需验证引物的扩增效率。相对基因表达量通过2?ΔΔCT公式计算（Livak和Schmittgen，2001年）。每次实验包括三个生物学重复样本以及三个技术重复样本。2.5 双链RNA的合成通过E-RNAi（https://e-rnai.dkfz.de/signaling/e-rnai3/）和SciTool RNAi Design工具（https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/DSIRNA_CUSTOM）选择了SfCPR的潜在靶序列（Bento等人，2020年；Li等人，2024b年）。通过针对REFSEQ_RNA数据库（人类、玉米、昆虫）进行BLASTn搜索，确保没有与非靶序列存在≥21个碱基对的连续相同序列，从而保证特异性（Bento等人，2020年）。使用含有T7启动子的引物进行PCR扩增（表1）。将扩增产物纯化后（使用Omega Bio-tek的凝胶提取试剂盒），按照制造商的说明，利用T7 RNAi转录试剂盒（Vazyme，中国南京）进行体外转录。所得双链RNA再次使用磁珠（Vazyme）按制造商说明进行纯化。通过用GoldView染色的1%琼脂糖凝胶（Solarbio，中国北京）检测其完整性，同时用分光光度计（KAIAO Technology，中国北京的MicroSpectrophotometer K5500Plus）测定浓度。同时还合成了靶向绿色荧光蛋白基因（GFP）的双链RNA（GenBank WP_270022569.1），作为双链RNA阴性对照。2.6 经口喂食和显微注射实现的RNA干扰对于经口给药的方式，将0.1克人工饲料块放入24孔板中，再加入5μg双链RNA（4~5μL），让其自然干燥。让二龄幼虫在饥饿状态4小时后，逐一放入各个孔中。对于显微注射，则使用Nanoject III装置（Drummond，美国）将0.9μg或1.8μg的双链RNA（600或1000nL）注入幼虫第2节和第3节腹部之间的膜层中（Zhou等人，2024年）。每种处理方式都涉及10只幼虫，共重复三次。以无核酸酶的水和dsGFP处理作为对照组。在处理后24、48和72小时分别采集幼虫样本，快速冷冻后储存在-70℃下。后续的RNA提取、cDNA合成以及RT-qPCR分析均按照前述步骤进行。2.7 SfCPR RNA干扰对λ-氰戊菊酯耐受性的影响此前已经通过饲料添加试验评估了幼虫对λ-氰戊菊酯的敏感性，probit分析显示，在48小时时，λ-氰戊菊酯的LC30和LC50值分别为112.8和206.1毫克/升（Li等人，2026年）。为了研究RNA干扰对λ-氰戊菊酯引发的死亡率的影响，在注射双链RNA处理24小时后，让幼虫接触LC30或LC50剂量的λ-氰戊菊酯。简要来说，将25克/升浓度的λ-氰戊菊酯微胶囊悬浮液（Syngenta，中国上海）用0.1%的Triton X-100稀释，制备成10倍工作溶液。10毫升该溶液与90毫升人工饲料混合，然后将0.1克饲料分配到24孔板中。在经过双链RNA处理24小时后，每孔放入一只二龄幼虫。在96小时内每天记录幼虫的死亡率。那些没有反应或运动不协调的幼虫被视为死亡（Bird，2017年）。对照组包括无核酸酶的水以及dsGFP+λ-氰戊菊酯组合。每种处理方式都使用10只幼虫，重复三次。在4天内每天记录死亡率。2.8 CS-TPP-双链RNA纳米粒子的制备、凝胶阻滞效果及加载效率通过离子凝胶法制备了壳聚糖-TPP-双链RNA纳米粒子（CS-TPP-dsRNA），仅做了一些细微调整（Dhandapani等人，2019年；Liu和Gao，2009年）。简而言之，在磁力搅拌下，将0.5毫升浓度为1毫克/毫升的TPP和0.5毫升浓度为0.25毫克/升的双链RNA逐滴加入0.5毫升浓度为5毫克/升、处于1%醋酸中的CS溶液中。经过15分钟培养后，将纳米粒子以13,000×g的速度离心10分钟，用无核酸酶的水洗涤三次，然后再重新悬浮在Milli-Q水中。通过在用GoldView染色的1%琼脂糖凝胶上加载5μL的裸双链RNA或含有加载缓冲液的纳米粒子复合物，来检测凝胶阻滞效果（Solarbio公司产品）。图像则用GenoSens 1880设备（Clinx，中国上海）拍摄。在上清液中的游离双链RNA通过260纳米波长进行定量，加载效率则按照以下公式计算：（总双链RNA量 - 游离双链RNA量/总双链RNA量）×100%。2.9 粒子尺寸、泽塔电位及形态结构使用Litesizer 500仪器（Anton Par GmbH，奥地利格拉茨市）测量了CS-TPP-dsRNA纳米粒子的平均粒径（Z均值）、表面电荷（泽塔电位）以及多分散性（PDI）。样品先经过超声处理，然后依次稀释50倍到1000倍，最终进行三次测量。对于透射电子显微镜观察（即TEM成像分析），则取3~5μL适当稀释后的纳米粒子悬浮液，涂在铜制网格上，用2%的磷钨酸染色，室温下放置10分钟，然后在HITACHI公司的HT7800型透射电子显微镜下观察图像（日本东京）。2.10 注射式纳米粒子-双链RNA的RNA干扰效率向二龄幼虫体内注射1μL含有1μg双链RNA的CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子。在注射后24、48和72小时分别采集幼虫样本进行表达分析。为了研究其对杀虫剂耐受性的影响，又在注射24小时后让幼虫接触LC30或LC50剂量的λ-氰戊菊酯。对照组包括无核酸酶的水以及纳米粒子-dsGFP+λ-氰戊菊酯组合。在4天内每天记录死亡率（每种处理方式10只幼虫，重复三次）。2.11 纳米粒子-双链RNA喂食对λ-氰戊菊酯耐受性及发育的影响在耐受性测试中，让幼虫连续两天每天摄入含有3.5μg纳米粒子-双链RNA的0.1克人工饲料（每只幼虫总共摄入7μg），之后再进行上述毒性生物测定。在发育状况评估中，让幼虫在1日、3日和5日分别摄入含有3.5μg纳米粒子-双链RNA的0.1克饲料（每只幼虫总共摄入10.5μg）。必要时可补充不含双链RNA的普通饲料。对照组则为无核酸酶的水以及纳米粒子-dsGFP组合。在4天内每天记录幼虫的死亡率；从第10天到第16天观察幼虫的化蛹情况，从第20天到第26天观察成虫的羽化情况。2.12 统计分析采用Levene检验来判断方差同质性。结果以平均值±标准差的形式表示。不同处理组之间的差异通过单因素方差分析进行评估，若差异显著则进一步通过Tukey HSD检验进行多重比较（p<0.05）。所有统计分析均使用SPSS v.26.0软件完成（IBM Corp.，美国纽约州阿蒙克市）。3. 结果3.1 从Spodoptera frugiperda中鉴定出SfCPR基因通过PCR成功扩增出了完整的SfCPR cDNA序列（见图S1A），该序列已被存入GenBank数据库，编号为PX789604。该序列全长2070个碱基对，编码一个包含689个氨基酸的蛋白质，预测分子量为77.0千道尔顿，等电点为5.3。系统发育分析表明，SfCPR与S. litura的CPR序列（QED40921）、S. littoralis的CPR序列（AFP20584.1）以及S. exigua的CPR序列（ADX95746）属于同一类群，共同构成了一个支撑度较高的鳞翅目昆虫基因群（见图1）。多序列比对结果显示，SfCPR含有典型的FMN结合结构域、FAD结合结构域以及NADP结合口袋，这些结构在各类昆虫的CPR蛋白中都具有高度保守性（见图2）。经典的FAD结合结构由R467、Y469和S470这三个保守残基构成，而S470-C641-D686-W688这四个催化残基则构成了还原酶功能所必需的活性位点。SfCPR与这些Spodoptera物种以及H. armigera的CPR序列的序列相似度超过93%，而与B. mori、B. mandarna和C. suppressalis的序列相似度则超过85%。下载：下载高分辨率图片（997KB）下载：下载完整尺寸图片图1. 不同昆虫物种CPR序列的系统发育分析。该邻接树是通过MEGA 11.0软件构建的。只有获得超过50%自举支持度（1000次伪重复检测）的节点才会被标出。本研究中研究的S. frugiperda的SfCPR序列用红色五角星标记。（关于图中颜色标注的含义，可参阅本文的网络版本。）下载：下载高分辨率图片（3MB）下载：下载完整尺寸图片图2. SfCPR序列的分析。(A) SfCPR的结构示意图。图中展示了FMN结合结构域、FAD结合结构域、NADP结合结构域以及催化残基，同时标出了用于RNA干扰的目标区域。(B) S. frugiperda的SfCPR序列（PX789604）与其他昆虫CPR序列的氨基酸序列对比。不同结构域中的结合位点对应的残基分别用红色方框标出。各CPR序列及昆虫物种的登录号如下：Anopheles gambiae（AAO24765）、Drosophila melanogaster（NP477158）、Bombyx mori（NP 001104834）、Nilaparvata lugens（AHB59865）、Plutella xylostella（NP001292469）、Helicoverpa armigera（ADK25060）。（关于图中颜色标注的含义，可参阅本文的网络版本。）3.2 SfCPR的时空表达模式RT-qPCR分析显示，SfCPR转录本在S. frugiperda的所有发育阶段及各种组织中都有表达，不过表达强度有所不同（见图3；图S2）。具体而言，发育阶段的表达情况显示，五龄幼虫的SfCPR表达水平最高，是卵期的2.0倍，其次是四龄幼虫，为卵期的1.5倍，六龄幼虫则为卵期的1.3倍（见图3A）。相反，成虫的SfCPR表达水平明显下降，仅为卵期的0.4倍。在组织特异性表达方面，SfCPR在中肠和脂肪体中的含量最高，分别是卵期的5.1倍和3.4倍，而前肠和头部的表达水平最低，前者为卵期的1.1倍，后者则以卵期为基准值1.0倍（见图3B）。下载：下载高分辨率图片（295KB）下载：下载完整尺寸图片图3. SfCPR的时空表达模式。(A) SfCPR在不同发育阶段的表达情况。所检测的发育阶段包括：卵期、第一至六龄幼虫（L1-L6）、蛹期以及成虫期。(B) 五龄幼虫中SfCPR的组织特异性表达情况。检测的组织包括头部（HE）、表皮（CU）、马氏管（MT）、脂肪体（FB）、前肠（FG）、中肠（MG）以及后肠（HG）。GAPDH和Actin 3α被用作内参基因。实验共进行三份生物学重复样本，每份样本又有三个技术重复。误差条上的字母表示通过单因素方差分析确定相对表达水平存在统计学显著差异，这些差异是通过Tukey HSD检验进行多重比较得出的（p<0.05）。3.3 RNA干扰介导的SfCPR沉默成功合成了靶向SfCPR的双链RNA（dsSfCPR）（见图S1B）。在处理后24、48和72小时，通过RT-qPCR检测了沉默效果（见图4）。摄入5μg的dsSfCPR并未在任何时间点显著改变SfCPR的转录水平（见图4A）。然而，注射0.9μg的dsSfCPR后，与dsGFP组和水分组相比，24小时、48小时以及72小时时的SfCPR表达水平分别降低了36.7%、39.8%和25.3%（见图4B）。将剂量增加到1.8μg后，基因沉默效果更为显著，相同时间点下的转录水平分别下降了40.7%、55.5%和42.2%（见图4C）。这些结果表明，在S. frugiperda中，通过RNA干扰实现SfCPR沉默具有剂量依赖性，且注射方式的沉默效果优于经口给药方式。下载：下载高分辨率图片（528KB）下载：下载完整尺寸图片图4. RNA干扰对SfCPR表达水平的影响。(A) 经口喂食5μg的dsSfCPR。(B) 注射0.9μg的dsSfCPR。(C) 注射1.8μg的dsSfCPR。以无核酸酶的水作为对照组。小写字母表示通过单因素方差分析确定存在统计学显著差异，这些差异是通过Tukey HSD检验进行多重比较得出的（p<0.05）。3.4 干扰SfCPR会提高S. frugiperda对λ-氰戊菊酯的敏感度为了研究SfCPR在杀虫剂耐受性中的作用，先在让幼虫接触LC30或LC50剂量的λ-氰戊菊酯之前，给它们注射0.9或1.8μg的dsSfCPR（见图5）。在LC30剂量下，与dsGFP对照组相比，经过0.9μg和1.8μg dsSfCPR处理的幼虫在96小时时的死亡率分别上升了20.0%和26.7%（见图5A和B）。同样，在LC50剂量下，96小时时的死亡率也分别上升了15.0%和20.0%（见图5C和D）。这些结果共同表明，沉默SfCPR会显著提高果实害虫对λ-氰戊菊酯的敏感性。下载：高分辨率图片（631KB）下载：完整尺寸图片图5. RNAi对果实害虫λ-氰戊菊酯敏感性的影响。(A, B)分别注入0.9和1.8微克dsSfCPR后，果实害虫幼虫在接触LC30剂量λ-氰戊菊酯时的死亡率。(C, D)分别注入0.9和1.8微克dsSfCPR后，幼虫在接触LC50剂量λ-氰戊菊酯时的死亡率。小写字母表示通过单因素方差分析及Tukey HSD检验进行多重比较后，各组死亡率之间存在显著差异（p<0.05）。3.5. CS-TPP-dsRNA纳米粒子的特性琼脂糖凝胶电泳显示，CS-TPP-dsRNA纳米粒子在加载区仍保留有核酸条带（图S1C），这说明带正电荷的CS-TPP有效中和了dsRNA的负电荷。透射电子显微镜观察发现，未与CS-TPP结合的dsRNA呈柔性链状，而与其结合后则形成平均直径为560.1±26.3纳米的近似球形纳米粒子（图6A，表2）。同时，随着dsRNA的加入，Zeta电位从44.6±1.2毫伏（CS-TPP）下降到26.7±0.1毫伏（CS-TPP-dsSfCPR）（图6B）。其PDI值为0.272±0.013，包封效率为77.8%（表2）。下载：高分辨率图片（726KB）下载：完整尺寸图片图6. CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子的特性。(A) dsRNA、CS-TPP以及CS-TPP-dsSfCPR的透射电子显微镜图像。(B) CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子的动态光散射分析。表2. CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子的特性。纳米粒子粒径（纳米）表面电荷（毫伏）多分散性指数（PDI）制备效率（%）CS-TPP a448.35±18.0544.60±1.1860.269±0.0085CS-TPP-dsSfCPR560.10±26.3026.67±0.0940.272±0.01377.82a这些数据来自我们之前的研究（Li等人，2026年）。3.6. 注入CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子可提升RNAi效率通过RT-qPCR检测了纳米粒子包裹的dsRNA的RNAi效率（图7A）。与CS-TPP-dsGFP对照组相比，注入1.0微克CS-TPP-dsSfCPR后，24、48和72小时时SfCPR的表达分别被显著抑制了50.5%、56.7%和52.5%。这相当于在同一时间点上，其敲低效率比裸露的dsSfCPR高出11.0%、14.4%和21.2%。下载：高分辨率图片（652KB）下载：完整尺寸图片图7. 注入1.0微克CS-TPP-dsSfCPR后，RNAi对SfCPR表达及λ-氰戊菊酯敏感性的影响。(A)注入CS-TPP-dsSfCPR后SfCPR基因相对表达水平的变化。(B, C)分别注入CS-TPP-dsSfCPR后，果实害虫在接触LC30和LC50剂量λ-氰戊菊酯时的死亡率。小写字母表示通过单因素方差分析及Tukey HSD检验进行多重比较后，各组平均值之间存在显著差异（p<0.05）。此外，生物测定也表明，注入1.0微克CS-TPP-dsSfCPR可显著提高果实害虫在λ-氰戊菊酯作用下的死亡率。在LC30剂量下，与CS-TPP-dsGFP组相比，96小时时的死亡率上升了35.0%，而与裸露的dsSfCPR相比则上升了15.0%（图7B）。在LC50剂量下，与CS-TPP-dsGFP组和裸露的dsSfCPR组相比，96小时时的死亡率分别上升了40.0%和26.7%（图7C）。这些结果证实，CS-TPP纳米粒子能提升果实害虫中的RNAi效率。3.7. 口服给予CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子可增加其对λ-氰戊菊酯的敏感性为评估口服RNAi递送效果，将二龄幼虫连续两天喂食含有3.5微克CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子的饲料，第三天再让它们接触LC30剂量的λ-氰戊菊酯。喂食CS-TPP-dsSfCPR的幼虫死亡率比喂食CS-TPP-dsGFP的幼虫高16.7%（图8A）。此外，与CS-TPP-dsGFP组（55%和43.3%）以及水对照组（93.3%和86.7%）相比，其化蛹率和成虫羽化率也显著下降（分别为40%和23.3%）（图8B和C）。这些结果表明，口服给药的CS-TPP-dsSfCPR能够增强果实害虫对杀虫剂的敏感性，并影响其幼虫化蛹和成虫羽化过程。下载：高分辨率图片（650KB）下载：完整尺寸图片图8. 通过口服给予CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子，对λ-氰戊菊酯敏感性、化蛹及羽化过程的影响。(A)喂食7微克CS-TPP-dsSfCPR后，果实害虫在接触LC30剂量λ-氰戊菊酯时的死亡率。(B, C)喂食7微克CS-TPP-dsSfCPR后，果实害虫在接触LC30剂量λ-氰戊菊酯时的化蛹率和羽化率。(D, E)连续喂食10.5微克CS-TPP-dsSfCPR后，化蛹率和羽化率的变化。小写字母表示通过单因素方差分析及Tukey HSD检验进行多重比较后，各组平均值之间存在显著差异（p<0.05）。3.8. 口服给予纳米粒子-dsRNA可延缓果实害虫的发育使用10.5微克CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子进行的喂养试验进一步研究了其对发育的影响。与CS-TPP-dsGFP对照组（第10天和第12天的化蛹率分别为90.0%和93.3%）相比，这些幼虫的化蛹率显著降低，分别为20%和73%（图8D）。同样，成虫羽化也受到延迟和抑制，第20天和第22天的羽化率分别为16.7%和65%，而CS-TPP-dsGFP对照组分别为86.7%和90.0%（图8E）。这些发现表明，通过口服给予CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子可抑制SfCPR的功能，从而干扰果实害虫的发育。4. 讨论尽管化学杀虫剂在控制包括果实害虫在内的多种重要农业害虫方面起着核心作用，但由于长期大量使用，这类害虫在全球范围内已演化出不同程度的化学杀虫剂抗性（Kenis等人，2023；Tay等人，2023）。日益严重的杀虫剂抗性凸显出亟需开发替代性且可持续的害虫管理策略。RNA干扰技术为害虫控制提供了一种极具前景的方法。本研究旨在寻找新的RNAi靶标，并评估纳米粒子包裹的dsRNA作为基于RNAi的生物杀虫剂在控制果实害虫方面的应用潜力。细胞色素P450单加氧酶在包括果实害虫在内的许多农业害虫的代谢抗性和杀虫剂解毒过程中都发挥着重要作用（Nauen等人，2022；Tay等人，2023）。作为CYP酶的重要电子传递伴侣，细胞色素P450还原酶在昆虫体内由CYP酶催化的解毒反应中起着关键作用（Farooq和Roberts，2010；Murataliev和Feyereisen，2000；Suwanchaichinda等人，2014）。已有研究表明，抑制CPR会显著影响斜纹夜蛾的CYP酶活性（Liu等人，2014）。因此，CPR基因也可能成为基于RNAi的害虫控制的有效靶标。在本研究中，成功从果实害虫中克隆并鉴定出了SfCPR基因。蛋白质序列比对显示，SfCPR与其他已知昆虫CPR蛋白具有相似的关键保守结构域，包括FMN结合结构域、FAD结合结构域以及NADPH结合结构域。发育阶段表达分析表明，SfCPR主要在果实害虫的晚期幼虫阶段表达，尤其是第四和第五龄期。这一时期正是幼虫的主要取食阶段，此时它们会接触到最多的外来毒素，如杀虫剂及其他环境毒素。组织特异性表达模式进一步显示，SfCPR在中肠和脂肪体中的含量最高。先前的研究已经证实，中肠、脂肪体以及马氏管是昆虫体内主要的解毒组织（Papapostolou等人，2022）。因此，这些组织中高水平的SfCPR转录本很可能表明它参与了外来毒素的解毒过程。这些发现与其他鳞翅目昆虫的类似表达模式一致，包括茶毒蛾（Liu等人，2013）、斜纹夜蛾（Zhao等人，2014）、印度棉铃虫（Shi等人，2021）以及棉红铃虫（Zhang等人，2018），这些都进一步证明了CPR酶在昆虫解毒过程中的关键作用。我们的RNAi生物测定结果显示，口服5微克dsSfCPR在72小时内并未显著降低SfCPR基因的表达水平。这一结果与以往的研究不同，那些研究中口服CPR特异性dsRNA能够成功降低目标基因的表达，并提高相应昆虫对杀虫剂的敏感性，比如小菜蛾（Li等人，2024b）、柑橘叶miner虫（Yuan等人，2021）以及荨麻夜蛾（Adesanya等人，2020）。有趣的是，最近有一项研究显示，在小菜蛾中口服dsCDA8会对幼虫的存活率和化蛹率产生显著影响，同时还会提高其对Bt生物杀虫剂的敏感性（Zhao等人，2026）。目前研究中出现的差异可能由多种因素造成。首先，RNAi效率在不同昆虫类群中存在显著差异，某些昆虫如鞘翅目昆虫的RNAi效应具有系统性且非常高效，而其他昆虫如鳞翅目昆虫的效率则相对较低（Shukla等人，2016）。其次，本研究中用于口服处理的dsRNA剂量可能低于以往研究中所使用的剂量。相比之下，注入0.9和1.8微克dsSfCPR则能显著降低SfCPR转录本的水平。较高剂量dsRNA带来的更强烈抑制作用，可能表明在果实害虫中存在剂量依赖性的RNAi效应。相应地，SfCPR表达的降低使得果实害虫对λ-氰戊菊酯的敏感性上升。这些结果与以往的研究高度一致，那些研究中CPR基因的敲低也提高了害虫对特定杀虫剂的敏感性，比如迁飞粉虱（Zhang等人，2017）、地中海实蝇（Liu等人，2015）、豌豆蚜（Qiao等人，2022）以及印度棉铃虫（Shi等人，2021）。总体而言，这些研究都表明，沉默CPR基因可通过削弱P450介导的解毒途径，协同增强多种昆虫对杀虫剂的敏感性（Berenbaum和Johnson，2015）。这进一步凸显了CPR酶作为昆虫P450依赖型外来毒素解毒过程中重要伴侣的角色。不过，在本研究中，我们仅评估了CPR基因对应的dsRNA与一种拟除虫菊酯类杀虫剂λ-氰戊菊酯之间的协同作用。未来还需要进一步研究，探讨CPR基因表达降低是否会导致果实害虫对不同化学类别的杀虫剂产生广谱敏感性。为克服RNAi效率较低的问题，人们越来越多地探索各种纳米材料作为载体，以提高dsRNA的稳定性及其在细胞内的摄取效率（Dhandapani等人，2022；Lu等人，2022；Theerawanitchpan等人，2012；Yan等人，2021）。在本研究中，通过离子凝胶法制备了CS-TPP包裹的dsRNA复合物（质量比为5:1:0.25），并通过凝胶滞留实验、动态光散射分析以及透射电子显微镜对其进行了表征。所得到的CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子呈球形，直径为560.1±26.3纳米，具有正Zeta电位，值为26.7±0.1毫伏，这一结果与之前在另一种昆虫中得到的数据相似（Schvartzman等人，2025）。不过，本研究中CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子的平均粒径大于之前在埃及伊蚊研究中得到的CS-TPP-dsIAP纳米粒子的粒径（约200纳米，Zeta电位为34.37±0.94毫伏）（Dhandapani等人，2019）。因此，后续研究应重点优化CS与TPP的比例，进一步调整粒子大小，以提升其性能。与裸露的dsRNA相比，注入CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子显著提升了基因沉默效率，并增强了果实害虫对λ-氰戊菊酯的敏感性，这充分体现了该纳米载体的保护作用及递送功能。虽然本研究中没有对CS-TPP-dsSfCPR复合物在体内的分布情况及其稳定性进行检测，但先前的研究已经证实了这类复合物具有出色的稳定性、良好的细胞摄取能力以及有效的生物分布特性。例如，通过FITC标记技术，已证明CS-TPP-dsRNA纳米粒子能够有效定位于埃及伊蚊的脂肪体和中肠组织中（Dhandapani等人，2019）。同样，在迁飞粉虱中，LmCht10基因对应的CS-dsRNA纳米粒子不仅能保护dsRNA免受核酸酶降解，还能通过荧光标记促进其穿透表皮细胞和中肠组织（Liu等人，2025b）。此外，壳聚糖还被证明可以通过网格蛋白介导的途径，促进赤眼蜂中的dsRNA内吞作用（Zhou等人，2023），同时在果实害虫中可推动dsRNA加工为siRNA（Gurusamy等人，2020a）。值得注意的是，最近还有研究指出，网格蛋白介导的内吞作用可能是各类昆虫吸收纳米粒子的最主要机制（Shi等人，2026）。综合这些研究结果可以看出，包括CS-TPP在内的各类纳米粒子可通过提高dsRNA的稳定性、促进其在细胞内的摄取以及促进其向内体释放，从而提升RNAi效率。不过，其具体的分子机制仍有待进一步阐明。未来的研究应利用荧光标记的dsRNA，深入研究纳米粒子在细胞内的内化过程、转运路径以及CS-TPP-dsSfCPR在体内的稳定性，同时结合西方印迹实验来定量检测CPR蛋白的表达水平。从应用角度来看，口服RNAi递送技术通过喂食、喷洒或灌溉等方式，为害虫管理提供了更为实用的手段（Liu等人，2025a；Yan等人，2021）。在本研究中，口服CS-TPP-dsSfCPR纳米粒子不仅提升了果实害虫对λ-氰戊菊酯的敏感性，还使得喂食该纳米粒子的幼虫的化蛹时间和成虫羽化时间分别延长了2到4天，这意味着果实害虫种群的生命周期会被延长。这些结果与以往的研究一致，比如通过口服Takr-h1基因对应的CS-dsRNA，可降低小菜蛾的蛹重和羽化率（Wang等人，2023）；而口服BmToll9-2基因对应的CS-dsRNA，则可使棉铃虫的相应基因转录本减少76%，同时使其幼虫和茧的体积变小（Liu等人，2025a）。在果实害虫中，口服CS-dsIAP纳米粒子可使幼虫的死亡率上升22%，同时使其蛹重和成虫重量分别减少27%和28%，相比裸露的dsIAP而言效果更为显著（Gurusamy等人，2020a）。同样，在迁飞粉虱中，口服CS-dsLmCht10纳米粒子也能使幼虫的死亡率比口服裸露dsRNA的高出46.7%（Liu等人，2025b）。所有这些研究都表明，口服基于CS的dsRNA能够提升昆虫对杀虫剂的敏感性，并干扰其正常发育。其他基于纳米载体的递送系统也为这一方法的可行性提供了进一步的支持。例如，通过口服给予脂质-dsIAP复合物，可使目标基因表达降低60%，幼虫死亡率达到55%（Gurusamy等人，2020b）。此外，连续7天同时使用局部涂抹和口服方式给予SPc-dsSfCDA1纳米颗粒，可使S. frugiperda的基因表达降低66%，幼虫死亡率达到40%（Chao等人，2023）。这些研究结果表明，纳米颗粒辅助的RNAi技术作为一种有效且具有协同作用的策略，可用于控制鳞翅目害虫。近年来，可喷洒型dsRNA纳米颗粒配方的发展为大规模害虫控制带来了更大希望，解决了裸露dsRNA存在的不稳定性及难以穿透昆虫表皮等缺陷（da Silva等人，2024；Gong等人，2023；Hu等人，2025；Quilez-Molina等人，2024；Yan等人，2025）。这些技术提升了RNA干扰技术在农业应用中的实用性。例如，对含有SPc的ATP-d和ATP-G（双基因RNAi）hpRNA进行叶面喷洒，可显著发挥杀虫效果，有效控制半翅目害虫M. persicae（Ma等人，2023）。同样，用SPc递送的dsTret1进行叶面喷洒，在温室和田间环境中均表现出高效的控害效果，喷洒7天后害虫密度可降低87%（Yang等人，2026）。此外，一些最新研究还表明，基于纳米载体的杀虫剂与dsRNA联合递送系统能够持续发挥控害作用，最具在实际田间应用中的潜力。例如，将基于金属有机框架的dsNlCYP与噻虫嗪纳米颗粒（噻虫嗪/dsNlCYP6ER1@ZIF-8复合物）共同递送，在盆栽实验中可有效控制N. lugens（Yu等人，2023）。另一项研究则采用基于粗糙表面空心介孔硅材料的噻虫嗪与dsRNA纳米颗粒（RHMS/IMI/dsCYP6CY13复合物）进行联合递送，对棉蚜的控害效果也相当理想（Lv等人，2023）。这些研究都凸显了纳米颗粒介导的RNAi技术作为害虫管理替代策略的巨大潜力。鳞翅目昆虫的研究结果进一步证明了这一方法的可行性。例如，在苹果小卷叶蛾中，将基于MON-NH2纳米载体的杀虫剂与针对dsCpCYP9As的dsRNA共同递送，可显著提高抗性种群对λ-氰戊菊酯的敏感性，从而在果园环境中实现高效控害（Hu等人，2025）。此外，自组装的纳米级杀虫剂/SPc/dsNrf2复合物还能产生协同效应，增加S. frugiperda对多种杀虫剂的敏感性，为减少用药剂量提供了新的途径（Yan等人，2025）。这些例子表明，基于纳米颗粒的RNAi技术可以有效地整合到不同的递送系统及害虫防治方案中，从而扩大其应用范围。不过，在实现大规模商业化应用之前，还有若干挑战需要解决，包括有效的目标基因筛选、dsRNA的大规模生产、dsRNA-纳米载体生产的成本问题，以及这些技术可能带来的环境影响。总体而言，本研究确定了NADPH-细胞色素P450还原酶基因（CPR）作为S. frugiperda的一种新的RNAi靶标，并证明经过CS-TPP包封的dsSfCPR纳米颗粒能显著提升RNAi的效率。这不仅使得SfCPR基因的表达进一步降低，还增加了S. frugiperda幼虫对λ-氰戊菊酯的敏感性。此外，口服这类纳米颗粒还会干扰S. frugiperda的生长与发育。这些发现表明，CS-TPP-dsSfCPR纳米颗粒有望成为应对S. frugiperda杀虫剂抗性的实用方法。未来的研究应重点优化纳米颗粒配方，扩大dsRNA的生产规模，完善田间应用策略，并评估此类可喷洒产品的生态安全性。

作者贡献说明：
徐志恒：概念设计、数据整理、实验研究、方法学、软件应用、初稿撰写。
徐伟焕：数据整理、定量分析、实验研究、方法学、软件应用、结果可视化、初稿撰写。
李晓杰：数据整理、定量分析、实验研究、方法学、资源提供。
沈洪进：实验研究、方法学。
范晓培：实验研究、方法学、资源提供。
朱梦瑶：实验研究、方法学。
Amir Khan Korai：实验研究、方法学。
Jamila Fatima：实验研究、结果可视化。
胡祖庆：方法学、软件应用、初稿撰写。
李永强：概念设计、数据整理、资金筹集、项目管理、监督指导、初稿撰写及审稿修改。