温度控制方法一步合成细胞相容性的透钙磷石矿化结冷胶/海藻酸盐微凝胶

《ACS Omega》：One-Step Synthesis of Cytocompatible Brushite-Mineralized Gellan Gum/Alginate Microgels via a Temperature-Controlled Approach

　　

在微创骨再生中，对可注射的生物活性微凝胶（MGs）需求很高，但它们的制造面临着重大挑战。具体来说，制造结构稳定（需要高聚合物浓度）且含有生物活性矿物相的复合MGs在技术上很困难，因为高粘度导致颗粒形成不一致和系统堵塞。研究人员的目标是开发一种新颖的温度控制乳化方法来克服这些限制，并从透钙磷石矿化的高浓度结冷胶/海藻酸钠（GG/SA）中生产并表征MGs。该装置使研究人员能够成功生产出均匀的球形MGs，其矿物含量可控高达30%，平均直径低于100 μm。扫描电子显微镜/能量色散X射线光谱（SEM/EDS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和热重分析（TG）证实了纳米晶透钙磷石相的成功掺入，这为MGs提供了显著的结构稳定性。体外实验表明，所有MGs与MG63成骨样细胞具有细胞相容性。动态条件下的细胞培养实验显示，矿化的MGs支持细胞粘附和铺展，与未矿化的对照形成对比，后者未观察到细胞锚定。这些发现表明，精确的温度控制是将高粘度GG/SA溶液加工成均匀MGs的成功策略。所得材料结合了纳米晶透钙磷石相的结构和生物活性优势以及GG/SA基质的既定生物相容性。最终，这项工作建立了一个易于使用且多功能的温度控制制造平台。虽然在这里成功展示了针对GG/SA/透钙磷石复合材料，但该装置可广泛应用于加工其他高粘度、热响应性生物聚合物，为组织工程中先进MGs的可调生产开辟了新途径。

骨缺损如创伤、骨质疏松和肿瘤切除导致的骨缺损常超过临界尺寸，需医疗干预。理想填充材料应兼具结构支撑、促骨再生能力，并可通过注射实现微创植入。水凝胶微凝胶（MGs）因高比表面积、可注射性及营养交换优势成为研究热点，但由高浓度聚合物（如结冷胶）制造结构稳定且含生物活性矿相的复合MGs面临粘度高导致喷头堵塞和粒径不均的技术瓶颈。本研究旨在开发一种温度控制乳化方法，一步合成透钙磷石矿化的结冷胶（GG）/海藻酸钠（SA）复合微凝胶。研究人员成功制备出均匀球形MGs，粒径<100 μm，矿物含量可控至30%，并系统评估了其理化性质及细胞相容性。该论文发表在《ACS Omega》。

主要关键技术方法包括：基于开源注射泵和自制温度控制系统的乳化装置，通过ESP32微控制器精确维持注射器、针头和反应容器温度（±0.1 °C）。水相含GG（2.5% w/v）和SA（0.5% w/v）溶于不同浓度Na₂HPO₄（50或100 mM）溶液，油相为含1% SPAN80的菜籽油，在60 °C下乳化后以CaCl₂交联。采用光学显微镜及ImageJ分析粒径分布；SEM/EDS、FTIR、XRD、TGA表征微观结构、元素组成和热稳定性；火焰原子吸收光谱（F-AAS）测定总钙含量；ICP-OES评估钙离子释放；静态与动态细胞培养结合AlamarBlue、活死染色和鬼笔环肽/DAPI染色评估MG63成骨样细胞相容性。

**3.1 微凝胶的形态和尺寸分布**：通过光学显微镜观察，非矿化MG（NMM）呈透明球形，矿化组MM50和MM100不透明且显示颗粒状内部结构。粒径统计（n=500）表明，随矿物含量增加，平均粒径依次递减（NMM 88 μm > MM50 79 μm > MM100 68 μm），且各组的右偏态分布及箱线图显示NMM存在更多离群值。单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验确认三组间差异显著（p < 0.001），说明高离子强度及原位沉淀促进粒子收缩。

**3.2 微凝胶的微观结构和化学成分**：SEM显示NMM干燥后塌陷皱缩，而矿化样品（尤其MM100）保持球形且表面多孔致密。EDS仅检测到矿化组含钙和磷，钙磷原子比MM50为2.00，MM100为1.78，证明磷酸钙相存在。

**3.3 傅里叶变换红外光谱**：FTIR证实矿化组在555 cm^-1处出现透钙磷石（CaHPO₄·2H₂O）的O–P–O弯曲振动峰，且MM100峰强高于MM50。同时1745 cm^-1处残余油相酯基峰极弱，表明洗涤彻底。

**3.4 热重分析**：TGA显示透钙磷石在150–220 °C失重约16%（脱结晶水），NMM在280 °C分解。矿化组残余质量随矿物含量增高：MM50约18%，MM100约35%，远高于NMM（9%），证实矿物负载可通过前驱体浓度调控。

**3.5 X射线衍射**：XRD确认MM100的衍射峰（2θ≈11.6°及23.4°）与纯透钙磷石标准品匹配，而NMM仅显示非晶弥散峰，证明矿相为纳米晶透钙磷石。

**3.6 总钙含量**：F-AAS测定总钙量：NMM为38.1 mg/g，MM50为54.1 mg/g，MM100为76.1 mg/g，组间差异显著（p < 0.001），进一步支持矿物含量可控性。

**3.7 钙离子释放曲线**：NMM钙释放可忽略，矿化组呈现持续释放：MM100在24 h释放17.9 mg/L，72 h增至24.4 mg/L，约占总钙储量的32%，表明透钙磷石溶解提供可控钙源。

**3.8 降解与结构稳定性**：在含血清培养基中14天观察，所有MG保持球形形态且无显著溶胀或碎裂，证明复合结构抵抗快速降解。

**3.9 生物学评估**：静态培养中，所有MG对MG63细胞代谢活性无不良影响，活死染色示高存活率。动态培养（摇床促进接触）中，矿化组第3天代谢活性显著高于NMM（p < 0.001）。荧光及共聚焦显微镜显示，NMM和MM50组细胞聚集于孔底而未定殖于MG表面；而MM100组细胞直接粘附并铺展于MG表面，肌动蛋白骨架充分延伸，形成三维细胞-材料整合。

**讨论总结**：研究成功克服高浓度GG加工的瓶颈，温度控制乳化制备了<100 μm均匀球形MG。透钙磷石掺入提供内源性支架支撑，使矿化MG在干燥和培养中保持球形。矿物含量可通过Na₂HPO₄浓度精准调控（TGA、F-AAS、钙释放数据一致）。动态细胞实验揭示矿化相的双重功能：低矿化（MM50）仅刺激代谢（离子信号），高矿化（MM100）同时提供粗糙表面促进细胞锚定，这是NMM和MM50无法实现的。14天降解实验验证了长期结构稳定性。该平台可拓展至其他热响应性生物聚合物，为可调注射性骨修复材料开发开辟新途径。

**研究结论**：本研究成功建立了一个基于精确温度控制乳化的易于使用且高度可定制的制造平台。该方法有效克服了将高浓度、高粘度多糖溶液加工成坚固、可注射尺寸微凝胶的技术挑战。重要的是，该平台技术不仅适用于GG，还可广泛用于其流变性质和凝胶化机制强烈依赖温度的其他生物聚合物。全面的表征确认了含特定量晶态透钙磷石的球形GG/SA微凝胶的形成。至关重要的是，动态条件下的生物学评价突显了矿相的功能必要性：纯多糖基质保持生物惰性，而矿化微凝胶支持稳健的细胞粘附和细胞骨架铺展。这些发现，结合已确认的Ca²⁺持续释放，使该材料成为骨再生的极具前景的候选者。已验证的生物活性为评估诱导成骨分化和调节巨噬细胞极化的高级体外研究铺平了道路，最终将导向其在骨愈合临床前体内模型中的评价。