MicroRNA-383-5p 调控 NADPH 氧化酶 4 减轻急性缺血性脑卒中血管内再通后出血转化并改善急性预后

《Frontiers in Immunology》：MicroRNA-383-5p regulation of NADPH oxidase 4 alleviates hemorrhagic transformation and improves acute outcomes after endovascular recanalization in acute ischemic stroke

　　

背景：再灌注治疗后的出血转化（HT）与急性缺血性脑卒中（AIS）患者的不良预后相关。在此，研究人员利用大脑中动脉闭塞（MCAO）和氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型，确定了microRNA-383-5p（miR-383-5p）在减轻HT相关损伤中的作用。方法：使用205只高血糖大鼠建立由5小时MCAO后机械再通诱导的HT模型，再通持续3小时和6小时；随后，在再通前静脉注射miR-383-5p agomir。分析内容包括脑含水量、出血严重程度、梗死体积、血脑屏障（BBB）破坏、神经元凋亡、活性氧（ROS）生成，以及miR-383-5p、NADPH氧化酶4（NOX4）、白介素1β（IL-1β）和BBB相关蛋白的表达水平。在OGD/R后，研究人员还评估了神经元中miR-383-5p和NOX4的表达，并在miR-383-5p和小干扰RNA干预后评估了神经元损伤和ROS生成。结果：在MCAO模型中，静脉注射miR-383-5p agomir增加了梗死周边组织中以及脑微血管内皮细胞、神经元和星形胶质细胞中的miR-383-5p水平，并抑制了NOX4的上调，这通过免疫组化荧光染色得到证实。升高的miR-383-5p水平减轻了缺血后机械再通后的脑水肿、梗死体积和出血严重程度；减少了ROS过度产生、神经元凋亡和星形胶质细胞中IL-1β的过度表达；并保持了BBB的完整性，从而改善了再通后3小时和6小时评估的急性神经学结局。在OGD/R后，神经元中检测到miR-383-5p水平降低和NOX4表达增加。升高的miR-383-5p水平减少了OGD/R处理神经元中的神经元损伤、ROS过度产生和NOX4过度表达。NOX4被确认为miR-383-5p的直接靶基因。结论：MiR-383-5p通过调控NOX4减轻了氧化应激损伤、神经元凋亡和炎症，并保持了BBB完整性。因此，miR-383-5p代表了减少出血转化并改善急性缺血性脑卒中血管内治疗后再通急性期预后的潜在治疗靶点。

论文解读

**研究背景与问题**

急性缺血性脑卒中（AIS）的再灌注治疗（如溶栓和血管内取栓）可显著改善患者预后，但治疗后发生的出血转化（HT）与不良长期预后密切相关。既往认为无症状性HT为良性现象，但新近研究表明其同样损害功能结局。因此，开发有效的神经血管保护策略作为再灌注治疗的辅助手段以减轻HT、改善AIS结局至关重要。HT的机制涉及氧化应激、炎症和凋亡。在神经系统中，NADPH氧化酶（NOX）是活性氧（ROS）的主要来源，调控神经血管细胞稳态及卒中关键过程。NOX4（在神经元和内皮细胞中高表达的NOX家族成员）是减轻脑缺血再灌注损伤和减少出血的靶点。MicroRNA-383（miR-383）是脑内神经元中高度富集的microRNA之一，临床血样分析显示其下调可能与AIS患者HT相关，且在机械再通诱导的HT模型梗死周边组织中miR-383-5p水平降低。然而，miR-383-5p在HT中的保护作用尚未阐明。生物信息学预测NOX4为miR-383-5p的靶基因。本研究旨在探究miR-383-5p通过直接靶向NOX4减轻HT并缓解炎症的保护作用，为急性脑卒中血管内再通后减少HT、改善急性结局提供新治疗靶点。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术与方法**

本研究使用成年雄性Sprague-Dawley高血糖大鼠（8-10周龄，250-280g）建立机械再通诱导的HT模型（5小时MCAO后分别再通3小时和6小时），并通过腹腔注射50%葡萄糖维持高血糖。静脉注射miR-383-5p agomir（50 nmol/kg）于再通前半小时。体外采用原代小鼠皮质神经元OGD/R模型。主要技术包括：定量RT-PCR检测miR-383-5p和NOX4表达；Western blot检测NOX4、claudin5、occludin蛋白水平；免疫组化荧光染色检测NOX4、IL-1β及细胞特异性标志物（NeuN、GFAP、Iba1、CD31）；ROS检测（DHE和DCFH-DA染色）；TUNEL+NeuN双标检测神经元凋亡；LDH释放检测神经元损伤；双荧光素酶报告基因验证miR-383-5p与NOX4 3'UTR结合。样本队列：大鼠模型每组5-6只；体外实验每组3个独立生物学重复。

**研究结果**

**1. 机械再通后大脑和血液中miR-383-5p水平降低，静脉注射miR-383-5p agomir可逆转这一变化**
通过RT-PCR分析，MCAO大鼠再通后1、3、6小时，血液和梗死周边组织中miR-383-5p下调；静脉注射miR-383-5p agomir后其水平恢复。

**2. 升高的miR-383-5p水平抑制脑水肿、梗死体积和出血，保持BBB完整性并改善急性结局**
与MCAO再通组相比，miR-383-5p agomir治疗组在再通3小时和6小时：血红蛋白含量指数降低（反映出血严重度减轻）；TTC染色显示梗死体积减小；Evans蓝外渗减少（BBB完整性保护）；脑含水量下降；神经功能缺损评分改善。

**3. 升高的miR-383-5p水平降低机械再通诱导的HT模型中脑微血管内皮细胞、神经元和星形胶质细胞的NOX4过度表达**
Western blot和RT-PCR显示，miR-383-5p agomir抑制了梗死周边组织中NOX4 mRNA和蛋白的上调。免疫组化荧光染色证实，NOX4在脑微血管内皮细胞（CD31⁺）、神经元（NeuN⁺）和星形胶质细胞（GFAP⁺）中的过度表达均被抑制，但在小胶质细胞（Iba1⁺）中无显著变化。

**4. 升高的miR-383-5p水平减少机械再通诱导的HT模型中ROS过度产生和神经元凋亡**
DCFH-DA和DHE染色显示，miR-383-5p agomir显著减少梗死周边区域过氧化氢和超氧阴离子的产生。TUNEL+NeuN双标显示，miR-383-5p agomir降低神经元凋亡比例。

**5. 升高的miR-383-5p水平减轻星形胶质细胞炎症并保持BBB相关蛋白**
免疫组化荧光染色显示，miR-383-5p agomir抑制了星形胶质细胞中IL-1β的过度表达。Western blot显示，miR-383-5p agomir部分恢复了缺血再灌注后减少的紧密连接蛋白claudin5和occludin。

**6. NOX4被鉴定为miR-383-5p的直接靶基因**
双荧光素酶报告基因实验结合位点突变技术证实，miR-383-5p直接靶向NOX4 3'UTR并抑制其活性。

**7. 升高的miR-383-5p通过抑制NOX4减轻OGD/R后神经元损伤**
OGD/R后神经元中miR-383-5p表达下降、NOX4表达上升。miR-383-5p mimics降低NOX4上调，而miR-383-5p inhibitor加重NOX4上调；NOX4 siRNA可逆转inhibitor的作用。miR-383-5p mimics抑制LDH释放，而inhibitor加重LDH释放。

**8. 升高的miR-383-5p通过调控NOX4抑制OGD/R模型中的ROS产生**
miR-383-5p mimics抑制OGD/R诱导的ROS（过氧化氢和超氧阴离子）增加，inhibitor则加剧ROS产生；NOX4 siRNA与inhibitor联用可减弱ROS上调。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究揭示了miR-383-5p/NOX4/ROS信号轴在减轻AIS再灌注后HT中的新作用。既往研究已分别报道miR-383-5p在脑缺血中的保护作用及NOX4在氧化应激和BBB破坏中的角色，但本研究首次在模拟临床血管内取栓的HT模型中证实miR-383-5p通过直接靶向NOX4发挥多细胞（神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞）保护效应，减少ROS、凋亡和炎症，保持BBB完整性，从而减轻HT并改善急性神经功能。研究同时讨论了局限性：未评估长期结局；模型为高血糖严重缺血状态，代表高风险亚组；未进行体内挽救实验以完全证实NOX4介导的保护作用；未全面评估BBB其他标志物、免疫细胞浸润及体外屏障功能；未进行正式样本量计算等。结论部分原文翻译如下：

**结论：** 我们的分析凸显了miR-383-5p在预防出血转化中的神经血管保护作用。分析显示，miR-383-5p通过靶向NOX4减轻了氧化应激损伤、神经元凋亡和炎症，并保持了BBB完整性。因此，miR-383-5p代表了减少出血转化并改善急性缺血性脑卒中血管内治疗后再通急性期预后的潜在干预靶点。miR-383-5p干预后的长期结局仍有待进一步评估。