CRISPR/Cas9介导的PHOX2B功能敲除在IMR32神经母细胞瘤细胞中通过离子通道基因失调损害神经兴奋性

《Frontiers in Physiology》：CRISPR/Cas9-mediated PHOX2B functional knock-out in IMR32 neuroblastoma cells impairs neuronal excitability through dysregulation of ion channels genes

　　

PHOX2B是自主神经系统发育的主转录调控因子，其突变导致神经嵴病，包括神经母细胞瘤和先天性中枢性低通气综合征（CCHS）。然而，PHOX2B靶基因的鉴定和功能相关性仍不完全明确，部分原因是缺乏稳健的细胞模型。通过CRISPR/Cas9工程，研究人员建立了PHOX2B功能敲除的IMR32神经母细胞瘤模型，并整合了转录组学、染色质结合、电生理学和活细胞成像分析来研究PHOX2B依赖性通路。随后，研究人员在携带不同PHOX2B突变的CCHS患者来源的iPSC衍生交感神经元中评估了所得结果的发育相关性。PHOX2B功能敲除（PHOX2B-KO）细胞表现出指示神经元成熟增强的形态学和分子特征。RNA-seq和ChIP-seq分析揭示了PHOX2B在调节离子通道（包括KCNQ5、SCN3A和RYR2）表达中的意外直接作用，主要通过转录抑制。功能上，PHOX2B KO细胞表现出内在电特性的显著改变，包括去极化静息膜电位、动作电位幅度降低、Ca²⁺反应减弱以及K⁺外流动力学深度改变。功能挽救实验证实，PHOX2B重新表达可恢复转录和电生理表型，从而建立了PHOX2B表达与维持内在兴奋性稳态之间的因果关系。将这些发现扩展到发育方面，从CCHS患者来源的iPSC分化的交感神经元表现出失调的成熟、转录网络重连以及相同离子通道基因的表达改变，支持它们与疾病的相关性。总之，研究人员的数据建立了PHOX2B功能敲除神经母细胞瘤模型作为功能基因组学的宝贵平台，能够系统分析PHOX2B靶点，并强调其在协调塑造神经元兴奋性和成熟的转录程序中的关键作用。

自主神经系统（ANS）发育依赖转录因子（如PHOX2B）的层级调控，PHOX2B（配对样同源盒转录因子2B）突变导致神经嵴病（包括神经母细胞瘤NB和先天性中枢性低通气综合征CCHS），但其靶基因鉴定和功能机制因缺乏稳健细胞模型而不明确。研究人员通过CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9系统）在IMR32（人神经母细胞瘤细胞系）中构建PHOX2B功能敲除模型，结合RNA-seq（转录组测序）、ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序）、全细胞膜片钳电生理和活细胞Ca²⁺/K⁺成像，揭示了PHOX2B直接调控离子通道基因（KCNQ5、SCN3A、RYR2）以维持内在兴奋性稳态，并在CCHS患者iPSC（诱导多能干细胞）衍生交感神经元（样本队列：对照系CTRL R1及3例患者系UMILi027-A、UMILi028-A、UMILi034-A）中验证其发育相关性。该研究确立了PHOX2B在协调神经元兴奋性和成熟转录程序中的关键作用，为功能基因组学提供平台，成果发表于《Frontiers in Physiology》。

### 3.1 Generation and characterization of a PHOX2B knockout model in IMR32 cells
通过CRISPR/Cas9在IMR32细胞中筛选获得纯合突变克隆A6.4（PHOX2B蛋白缺失，mRNA略增）。形态学观察显示KO细胞突起延长、胞体延长，提示神经元成熟增强；Western blot和qPCR检测显示TUBB3（β3-微管蛋白）、SYT（突触结合蛋白）、STX（突触融合蛋白）和PHOX2A（PHOX2B旁系同源物）上调，ChAT（胆碱乙酰转移酶）下调，DBH（多巴胺β羟化酶）不变，表明PHOX2B缺失促进沿神经元谱系分化并偏向去甲肾上腺素能表型。

### 3.2 PHOX2B modulates the electrical properties of neuroblastoma IMR32 cell line
全细胞电流钳记录显示，与对照和PHOX2B再表达（KO_rescue）细胞相比，KO细胞静息膜电位（RMP）去极化、膜电容（Cm）降低、输入电阻（Rinput）无差异，且动作电位振幅（ΔV）显著减小，阈值电流密度有增加趋势，提示内在兴奋性降低。活细胞Ca²⁺（K-GECO1）和K⁺（GINKO1）成像显示，尼古丁刺激后KO细胞Ca²⁺内流峰值和曲线下面积（AUC）减小、达峰时间缩短，K⁺外流最大ΔF/F0和AUC显著降低；PHOX2B再表达恢复Ca²⁺和K⁺瞬变，确认PHOX2B缺失导致离子动力学异常。

### 3.3 Ion channels are newly identified PHOX2B target genes
IMR32细胞的PHOX2B ChIP-seq鉴定8512个结合峰，富含同源框基序（ATTA），分布以远端基因间区（50.38%）和基因内区（45.48%）为主。GO分析富集离子通道（钠、钾、钙离子运输）和突触传递相关条目。与RNA-seq鉴定的751个PHOX2B依赖性基因交集，得到KCNQ5（Kv7.5钾通道）、SCN3A（Nav1.3钠通道）、RYR2（Ryanodine受体2）和SLC44A1（胆碱转运体）为直接靶点，其中前三者受PHOX2B负调控（在KO中上调，再表达后恢复），SLC44A1受正调控。qPCR验证了KCNQ5、SCN3A、RYR2的转录调控模式。与已发表的其他神经母细胞瘤细胞系ChIP-seq数据比对确认了结合位点。

### 3.4 PHOX2B mutations disrupt the coordinated progression of sympathetic lineage commitment and ion channels expression
从对照和CCHS患者（UMILi027-A 20/25，UMILi028-A 20/25，UMILi034-A 20/26）iPSC分化交感神经元，qPCR显示突变系在D10/D14阶段SOX10、ASCL1持续高表达，PRPH、DBH成熟标记激活减弱，ChAT持续表达；免疫荧光显示TH（酪氨酸羟化酶）染色减弱、TUBB3束状结构异常。基因相关性分析表明，对照系中标记间呈显著正相关（层级协调），而突变系中HOXC基因与交感标记（PHOX2B、ISL1、PRPH、DBH）呈负相关，提示转录网络重连。离子通道表达谱显示，D14时突变系RYR2降低幅度与对照类似、SCN3A显著升高、KCNQ5在20/25先天性患者中降低幅度减小；D28/35时差异持续存在，表明突变蛋白导致发育时序错位。

讨论部分指出，PHOX2B缺失促进神经元成熟而非去分化，并发现PHOX2B通过抑制离子通道（KCNQ5、SCN3A、RYR2）维持电特性稳态；CCHS突变导致发育转录网络解耦和离子通道表达失调，提示电生理成熟与谱系决定之间的时序紊乱，可能为疾病表型（如呼吸调控缺陷）提供机制基础。研究结论：该工作揭示了PHOX2B在神经母细胞瘤细胞中控制转录和功能程序的新作用，将靶点扩展至离子通道基因，通过CRISPR、转录组、ChIP-seq和电生理整合分析确定了PHOX2B在调节神经元离子流和兴奋性中的未被重视的角色；提出的KO模型平台可用于验证新靶点和致病机制，并发现下游通路可能为CCHS、NB和HSCR等疾病提供治疗靶点。