基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的有效方法用于定量薄壳山核桃（Carya illinoinensis）中的赤霉酸（GA）

《Frontiers in Plant Science》：An effective enzyme-linked immunosorbent assay-based method for quantification of gibberellic acid in pecan (Carya illinoinensis)

　　

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种可靠且低成本的植物赤霉酸（Gibberellic Acid, GA）定量方法，但由于组织硬度和/或富含代谢物，将此方法应用于某些植物组织具有挑战性。薄壳山核桃（Carya illinoinensis）的芽和树皮组织便是此类实例。本研究旨在为这些薄壳山核桃组织建立一种有效的基于ELISA的GA定量方法。研究人员测试了不同组织用量及组织与溶剂甲醇的重量比对GA检测的影响。研究人员还测试了热干燥和冷冻干燥以及新鲜材料在-80°C长期储存是否影响GA检测。研究结果表明，使用0.0125±0.0005克（g）的热干燥或冷冻干燥组织，并采用相对较低的组织与甲醇比例，在ELISA检测中能一致获得高GA浓度，且长期储存在-80°C的薄壳山核桃样品中GA水平稳定。研究结果还显示，芽中的GA浓度高于树皮。这些发现表明，该方法能有效检测少量薄壳山核桃组织中的GA，且对新鲜或冷冻储存样品进行热干燥可获得满意的GA定量结果。此外，发现木质部和树皮中的GA浓度与芽中的GA浓度呈正相关，这有助于根据树皮中的GA浓度估计芽中GA浓度的大部分变异，因为通过实验确定早期发育阶段小芽中的GA浓度可能具有挑战性。最终的加标回收试验以GA（来自ELISA试剂盒）作为加标物以及样品对样品加标，证实样品提取物在低和高加标水平下均表现出可接受的回收率，范围为72-102%，表明基质效应和酚类干扰未显著影响结果。

## 论文解读：基于ELISA优化方法定量薄壳山核桃组织中赤霉酸的研究

### 研究背景与意义

植物激素在不同组织、发育阶段及环境条件下的含量差异显著，其动态变化是植物发育及响应环境信号机制的核心组成部分。准确测定少量组织中的激素浓度，对于理解激素水平与激素响应基因表达量之间的定量关系至关重要。赤霉酸（Gibberellic Acid, GA）作为调控植物发育和胁迫应答的关键植物激素，其在多年生木本植物（如薄壳山核桃，*Carya illinoinensis*）枝条不同组织中的定量，可为揭示GA如何影响雌雄花发育提供关键证据。传统液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法虽灵敏，但设备昂贵且需专业技能，不适用于小型实验室。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是低成本替代方案，但现有试剂盒方案针对软组织设计，要求较大样品量（如1克鲜重），且缺乏处理坚硬组织（如含韧皮部的树皮和芽）的样本前处理关键信息。薄壳山核桃的木质化组织富含代谢物，给ELISA应用带来挑战。因此，研究人员开展了本研究，旨在建立一种有效、简便、基于ELISA的GA定量方法，适用于薄壳山核桃的芽和树皮组织。该研究成果发表在《Frontiers in Plant Science》。

### 关键技术与方法

样品来源为美国奥克拉荷马州立大学Cimmaron Valley研究站的两棵1994年栽种的Pawnee薄壳山核桃树，于2024年7月及2025年3月三次采集。主要技术方法包括：将枝条分离为木质部、树皮和芽；采用热干燥（60°C，4天）或冷冻干燥（-42°C，0.1 mbar，2天）处理样品；研磨后精确称量干燥组织（最低0.0125 g）；使用改进的提取方案（Protocol D）：以80%甲醇为溶剂，组织与溶剂比例为1:40（重量/体积），4°C涡旋24小时，两次提取，合并上清后用石油醚液-液萃取净化，省略旋转蒸发步骤；采用竞争性ELISA试剂盒（Cloud-Clone Corp.）在450 nm处测定吸光度，基于半对数标准曲线计算GA₃浓度；通过两种加标回收试验（试剂盒标准品加标和样品间加标）评估基质效应和酚类干扰。

### 研究结果

**3.1.1 减少组织量与组织-溶剂比例提高了GA检测效果**
研究人员通过逐步减少干燥组织量（从0.2 g降至0.0125 g）并调整组织与甲醇比例（从1:6降至1:40），发现Protocol D在所有测试组织（芽、树皮、木质部）中获得最高且最一致的GA浓度，表明降低样品量和组织-溶剂比例可有效减少固体残留物干扰，提高检测效率。

**3.1.2 冷冻干燥与热干燥在GA检测中产生类似结果**
比较两种干燥方法，统计检验（Steel-Dwass非参数检验）表明，无论是将芽和树皮样品合并分析还是分别分析，冷冻干燥与热干燥样品间的GA浓度均无显著差异（p>0.05），说明即时烘箱干燥不影响GA检测，为实验室样品处理提供了灵活性。

**3.1.3 -80°C储存不影响GA检测**
将样品在-80°C短期储存4天后进行热干燥，与立即热干燥样品比较，GA浓度无显著差异（p=0.8703）。稳定性计算显示，树皮、芽和木质部的相对稳定性分别为97.1%、99.0%和104.7%。同时，无论储存条件如何，芽中的GA浓度均显著高于树皮（p<0.001）。

**3.1.4 加标GA成功回收**
两种加标方法均获得可接受的回收率。使用试剂盒GA标准品加标时，两个加标水平（4444 ng/mL和2857 ng/mL）的回收率为74.35%~102.53%；使用样品间加标时，三个加标浓度（1539.5、2052.7、2771.1 ng/mL）的回收率为81.8%~117.6%，均在80%-120%的公认范围内，表明基质效应和酚类干扰未显著影响结果。

**3.1.5 方法验证**
批内精密度以变异系数（Coefficient of Variation, CV%）评估，Protocol B-D条件下树皮和芽的CV值通常低于15%，储存方法实验中所有组织的CV值为4.83%~9.45%，远低于植物激素ELISA重复性通常接受的15%-20%阈值，表明方法具有良好重复性。

### 讨论与结论

研究人员优化了现有ELISA试剂盒方案，通过降低干燥组织量（至0.0125 g）和调整组织-溶剂比例（至1:40），成功应用于薄壳山核桃的木质化组织。热干燥处理有效解决了研磨难题，且与冷冻干燥效果相当；-80°C短期储存不影响GA稳定性。芽中GA浓度最高，茎组织（木质部、树皮）GA浓度与芽GA浓度呈显著正相关（R²分别为0.61和0.54），表明植物不同部位GA浓度受合成与运输的协调控制。该方法的建立为小型实验室开展大量样品中GA定量研究提供了经济、简便且有效的手段。

**结论翻译**：本研究通过减少干燥组织量和降低组织与溶剂比例，优化了适用于薄壳山核桃组织的标准ELISA试剂盒方案。修订后的方法通过减少干扰分光光度计读数的固体残留物，实现了GA的可靠检测。本研究中采用的热干燥有效解决了木质化或坚硬组织的研磨难题。在所有测试组织中，芽表现出最高的GA水平。茎与芽GA浓度之间观察到的相关性支持了植物不同部位GA浓度受合成与运输的适度协调控制的假设。