利用荧光标记DPA714在神经炎症动物模型中对TSPO信号进行多维度解码

《Journal of Neuroinflammation》：Multi-dimensional decoding of the TSPO signal in animal models of neuroinflammation using fluorescence-conjugated DPA714

　　

神经难分述，神经炎症是多种中枢神经系统（central nervous system, CNS）疾病的核心病理过程。尽管以易位蛋白（translocator protein, TSPO）为靶点的正电子发射断层成像（positron emission tomography, PET）（如¹⁸F-DPA-714）已被广泛用于活体炎症成像，但其成像信号背后的细胞异质性和功能状态仍不清楚，严重限制了其机制研究和临床转化价值。本研究利用多功能荧光TSPO探针（Cy5-PEG₃-DPA714）建立了多维度解码框架，实现了在体、组织和单细胞水平对神经炎症中TSPO信号的系统分析。多种动物模型证明了该探针能够无创动态监测急性和慢性神经炎症。组织病理学证实TSPO信号主要来源于活化Iba1⁺小胶质细胞。利用该探针的荧光特性，研究人员通过流式细胞术有效分离了具有不同TSPO信号特征的特定小胶质细胞亚群。单细胞分析揭示TSPO信号特异性富集于TSPO probe^high小胶质细胞亚群。重要的是，该亚群与疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）具有共同特征，表现出强烈的促炎表型和显著的代谢重编程。此外，研究人员发现TSPO probe^high小胶质细胞高度依赖集落刺激因子1受体（Colony Stimulating Factor 1 Receptor, CSF1R）信号通路，使用CSF1R抑制剂（PLX3397）进行选择性清除可减轻神经炎症。本研究通过多模态方法系统解码了神经炎症中的TSPO信号，为精准靶向特定病理性小胶质细胞亚群的治疗策略提供了新见解和工具。

神经炎症是多种中枢神经系统（CNS）疾病的共同病理通路，包括脑卒中、多发性硬化（multiple sclerosis, MS）和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD），其特征为胶质细胞持续活化、炎症介质释放和神经功能受损。作为CNS的固有免疫细胞，小胶质细胞通过在 homeostatic（稳态）和 pathogenic（致病性）功能状态之间的转换，在疾病发生和进展中发挥着关键的调控作用。近年来，单细胞转录组学技术的进步证实，病理应激可驱动小胶质细胞发生深刻的表型转变。这些活化状态被称为疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM），其特征为独特的转录组特征，即促炎活性与显著代谢重编程偶联。动态分析DAM的空间分布和分子特征对于理解疾病机制和开发靶向治疗至关重要。

18 kDa易位蛋白（translocator protein, TSPO）定位于线粒体外膜，在活化的小胶质细胞或星形胶质细胞中显著上调，因此成为监测神经炎症的核心靶点。TSPO-正电子发射断层成像（PET）（如¹⁸F-DPA-714）是临床评估炎症的主要工具，已广泛用于研究各种神经炎症性疾病，其信号强度与疾病严重程度和和治疗反应密切相关。值得注意的是，¹⁸F-DPA-714在人体中的临床应用需事先对TSPO rs6971单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）进行基因分型，该多态性直接影响示踪剂结合。尽管TSPO-PET具有重要的临床和前临床价值，但其生物学解读的未知性限制了其转化应用：由于TSPO-PET无法同时识别、分离和深入分子表征摄取示踪剂的特定细胞，TSPO信号的确切细胞起源和功能状态仍不清楚。

本研究发表于《Journal of Neuroinflammation》，旨在建立一种连接宏观成像与细胞水平生物学的策略。研究人员使用多功能近红外（near-infrared, NIR）荧光探针Cy5-PEG₃-DPA714，该探针保留了经临床验证的TSPO靶向配体DPA-714的靶向能力。通过整合在体成像、组织病理学、流式细胞术分选和单细胞转录组学，系统解码神经炎症中TSPO信号在时空、细胞和功能维度的生物学意义。

本研究用到的主要关键技术方法包括：多功能近红外荧光TSPO靶向探针（Cy5-PEG₃-DPA714）的合成与验证；多种神经炎症动物模型（急性脑出血模型、脑缺血模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎模型和双环己酮草酰二腙诱导的脱髓鞘模型）的建立；活体近红外成像（使用IVIS Lumina X5 Spectrum系统）；免疫荧光组织病理学分析；流式细胞术分选TSPO probe^high和TSPO probe^low细胞群体；以及单细胞RNA测序和生物信息学分析。

特异性结合验证结果表明，研究人员通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）和离子阱质谱（ion-trap mass spectrometry, ITMS）验证了TSPO探针的纯度。在BV2细胞中，无论有无脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激，探针信号与TSPO特异性抗体信号均高度共定位，证实了其细胞水平的分子靶向性。在急性脑出血和脑缺血模型中的病理共定位验证显示，探针信号精确定位于TSPO高表达区域；活化小胶质细胞较静息小胶质细胞显示显著更高的TSPO探针摄取，表明该探针可有效检测炎症微环境中TSPO的上调。

在体成像动态监测结果表明，健康成年小鼠尾静脉注射Cy5-PEG₃-DPA714后，探针在小鼠脑内保持稳定，适合在体成像应用。在急性脑出血模型中，病变半球TSPO荧光强度显著高于对侧，显示出优异的对比度和可视化效果。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）模型中，探针在尾静脉注射后10分钟内快速积累并达到峰值信号强度，随后在监测窗口期内维持相对稳定的高强度信号。在双环己酮草酰二腙（cuprizone, CPZ）诱导的脱髓鞘模型中，纵向成像揭示了TSPO信号随疾病进展的动态变化：在急性脱髓鞘期（第3周）达到峰值，随后在 remyelination（髓鞘再生）期（第5周）减弱，并在慢性期（第12周）进一步显著降低。这种快速的药代动力学特征和稳定的信噪比证明了该探针精准捕捉神经炎症时空演变的潜力。

TSPO信号细胞来源鉴定结果表明，通过EAE和CPZ炎症模型中的多重荧光共染色分析，研究人员识别了TSPO信号的细胞来源。高分辨率免疫荧光成像显示，Cy5-PEG₃-DPA714探针的TSPO信号主要定位于 amoeboid（阿米巴样）Iba1⁺小胶质细胞，与GFAP⁺星形胶质细胞的共定位极少。定量分析进一步证实探针信号主要来源于Iba1⁺小胶质细胞，表明这些细胞是炎症期间TSPO信号升高的主要贡献者，而非GFAP⁺星形胶质细胞。

TSPO探针分选与单细胞转录组学分析结果表明，利用TSPO探针与流式细胞术的兼容性，研究人员在CPZ模型中直接根据探针平均荧光强度特征分选出TSPO probe^high和TSPO probe^low脑小胶质细胞，结合单细胞RNA测序分析进一步在细胞功能水平解码TSPO信号。研究人员鉴定出三个细胞簇，包括Mrc1⁺Lyz2⁺巨噬细胞、Apoe⁺Fth1⁺活化小胶质细胞和P2ry12⁺Tmem119⁺稳态小胶质细胞。TSPO probe^high小胶质细胞高度表达Jun、Egr1、Ccl3和Ier5等与炎症相关的标志基因。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示，TSPO probe^high小胶质细胞表现出显著的神经退行性和促炎转录特征，氧化磷酸化显著激活。进一步分析揭示TSPO probe^high小胶质细胞存在溶酶体功能、抗原呈递、吞噬能力和脂质代谢受损。这些结果显示TSPO probe^high小胶质细胞具有类似DAM的独特转录特征。

值得注意的是，尽管TSPO probe^high小胶质细胞主要对应活化小胶质细胞，但TSPO probe^high群体中仍存在少量"非活化"小胶质细胞。有趣的是，这些TSPO probe^high "非活化"小胶质细胞也表现出比TSPO probe^low "活化"小胶质细胞更高水平的炎症和代谢基因集上调，这可能代表特定致病性小胶质细胞的稳态。此外，TSPO probe^high小胶质细胞同时表现出Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）和布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase, BTK）通路的激活，以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）和缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）信号通路的显著上调。

TSPO probe^high小胶质细胞对CSF1R抑制敏感结果表明，转录组通路分析揭示TSPO probe^high小胶质细胞亚群中CSF1R信号显著增强，提示CSF1R是潜在治疗靶点。基于上述结果，研究人员假设TSPO probe^high小胶质细胞对CSF1R抑制敏感。在EAE模型中使用CSF1R抑制剂（PLX3397）治疗，不仅有效改善神经功能，还显著降低全脑TSPO信号摄取。流式细胞术定量进一步证实，CSF1R抑制剂选择性清除TSPO probe^high致病性小胶质细胞，同时对低表达的稳态小胶质细胞影响最小，从而显著缓解神经炎症。

讨论部分总结如下：本研究建立了TSPO信号的多维度解码策略，通过整合纵向在体成像、特异性探针标记的组织病理学和单细胞转录组学分析，系统揭示了神经炎症中TSPO信号的空间、细胞和功能含义。TSPO信号反映特定致病性小胶质细胞亚群的功能转变，而非单纯的细胞密度增加。TSPO probe^high小胶质细胞亚群以促炎、高代谢特征和对CSF1R抑制的敏感性为特点。这些发现将TSPO从广泛的炎症成像标志物提升为神经炎症演变和代谢状态的关键干预靶点，填补了TSPO-PET研究领域长期存在的空白。

TSPO信号的细胞来源，特别是小胶质细胞和星形胶质细胞的相对贡献，一直是该领域的讨论焦点。炎症刺激下的BV2细胞和病理共定位分析显示，TSPO信号在Iba1⁺小胶质细胞中显著富集。与近期多项发现一致，研究结果支持疾病状态下TSPO信号与小胶质细胞负荷高度相关、而非反映细胞密度或TSPO表达增加的观点。这种细胞特异性确认解决了PET成像中的分辨率缺陷。传统TSPO-PET放射性示踪剂如¹⁸F-DPA-714缺乏细胞水平分辨率，而本研究开发的Cy5-PEG₃-DPA714荧光探针通过整合流式细胞术和单细胞RNA测序，实现了单细胞水平表型的精确分离和分子解码。此外，传统免疫组织化学虽能提供详细的细胞图像，但无法随时间追踪炎症；相比之下，Cy5-PEG₃-DPA714探针提供优异的近红外成像，用于实时、高质量追踪在体神经炎症动态。这种纵向监测能力对于理解生物学含义至关重要。

本研究报道了TSPO信号从细胞定位到功能表征的关键转变。尽管长期被认为是"胶质细胞活化标志物"，但近期研究表明这一解释并非普遍适用。利用研究的探针分选和单细胞RNA测序，研究人员鉴定了TSPO probe^high小胶质细胞亚群，提供了超越细胞密度的功能视角。该亚群与DAM特征一致，与微胶质细胞转变为致病性的时间和空间相关。通路分析显示，TSPO probe^high小胶质细胞不仅表达促炎基因，还经历代谢重编程和功能改变，这解释了为什么TSPO信号增加常伴随严重组织损伤和从防御到损伤的转变。因此，TSPO成像不仅定位炎症病变，还作为"在体代谢监测器"评估脑内免疫细胞的生物能量状态。

CSF1R信号通路对小胶质细胞稳态和增殖至关重要。在MS患者中，CSF1R表达在脱髓鞘皮质白质病变周围的小胶质细胞中强烈上调，其配体M-CSF水平也升高。这些发现表明CSF1R信号通路可能参与塑造MS中的致病性炎症环境，因此其抑制正在MS治疗中进行探索。然而，CSF1R抑制在神经炎症中的治疗疗效严格依赖于阶段。虽然预防性干预有效抑制初始炎症级联，但晚期清除常因破坏免疫稳态而加重疾病严重程度。研究发现TSPO探针特异性标记DAM，信号强度在疾病高峰期增加、晚期降低，从而有效指示小胶质细胞靶向CSF1R干预的时间窗口。此外，CSF1R信号通路在TSPO probe^high小胶质细胞中特别活跃，PLX3397表现出强亚群选择性，优先清除TSPO probe^high致病性小胶质细胞亚群，同时相对保留稳态小胶质细胞（TSPO probe^low）。这提示治疗疗效可能源于对驱动细胞群的精确清除，而非全局小胶质细胞消融，可能减轻广泛清除相关的副作用。

尽管本研究通过多维度分析提供了详细见解，仍存在一些局限性。首先，动物模型无法完全复制人类神经系统疾病的复杂性和异质性，影响成像与细胞功能之间的直接联系。需要在人体中验证这些亚群的存在和临床相关性。其次，花菁5（Cyanine 5, Cy5）染料的组织穿透性限制了其在大动物或深部人脑结构中的应用。传统TSPO放射性药物（如¹⁸F-DPA-714）因其无限制的三维定位和深部组织穿透仍是临床神经炎症成像的金标准；相比之下，Cy5偶联探针的较大分子尺寸固有地限制了其到达深部神经 anatomical（解剖）结构，可能导致这些区域活化小胶质细胞的低代表性。未来研究应开发具有改善组织穿透性的第二近红外区域（NIR-II）探针，结合PET/MRI以提供更深入的临床见解。最后，疾病不同阶段高表达和低表达TSPO的小胶质细胞之间的动态变化是未来验证和扩展的关键。

从临床转化角度，本研究使用多功能探针在成像、细胞和分子维度解码了神经炎症中TSPO信号的生物学意义，将TSPO从粗略的炎症标志物推进为精确的细胞状态指示物。TSPO表达扩大与小胶质细胞代谢重编程和致病性转变相关，证明了靶向干预的可行性。

研究结论：本研究建立了TSPO信号的多维度解码策略。通过整合纵向在体成像、特异性探针标记的组织病理学和单细胞转录组学分析，系统揭示了神经炎症中TSPO信号的空间、细胞和功能含义。TSPO信号反映特定致病性小胶质细胞亚群的功能转变，而非单纯的细胞密度增加。TSPO probe^high小胶质细胞亚群以促炎、高代谢特征和对CSF1R抑制的敏感性为特点。这些发现将TSPO从广泛的炎症成像标志物提升为神经炎症演变和代谢状态的关键干预靶点，填补了TSPO-PET研究领域长期存在的空白。