综述：姜（Zingiber officinale Roscoe）体外再生与组织培养生物技术进展

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：In vitro regeneration and biotechnological advances in tissue culture of Zingiber officinale Roscoe: a comprehensive review

　　

姜（Zingiber officinale）为姜科（Zingiberaceae）重要药用植物，其根茎作为最具经济价值和治疗价值的部位，被广泛应用于缓解糖尿病、癌症及心血管疾病等与氧化应激相关的疾病。由于姜开花结实极少，生产上主要依赖根茎进行营养繁殖，该方式不仅成本高昂，还易导致病害在栽培中传播蔓延。为克服上述局限，体外培养（in vitro culture）技术被提出作为替代方案，既可提供无病毒种苗，又能为遗传改良提供先进的生物技术平台。本综述系统评价了姜组织培养领域的最新进展、现存挑战及未来前景，综合分析了直接和间接体外再生、体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）、微根茎（microrhizome）诱导、细胞悬浮培养、原生质体分离与融合、体细胞杂交（somatic hybridisation）、遗传忠实性（genetic fidelity）评价、转基因与基因编辑、试管苗驯化以及特异性代谢产物生产等多种基于组织培养的策略。综述 highlighting 了再生技术的显著进展，同时指出体细胞胚胎发生效率低下、体细胞杂交与基因编辑成功有限、以及体外系统生物活性化合物产量欠佳等持续性挑战，并针对提高繁殖效率、遗传增强及植物化学成分生产等策略提出建议。

体外再生为生产无病原姜种苗提供了高效途径，包括直接和间接培养系统，其成功依赖于外植体类型与处理、培养基组成、培养环境条件及植物生长调节剂（plant growth regulator, PGR）的应用等关键因素。

**直接体外再生**

直接体外再生指外植体组织不经过愈伤组织（callus）阶段直接发育成芽或完整植株，可最大限度降低体细胞克隆变异（somaclonal variation）风险，保持再生植株遗传忠实性。该途径在姜中已广泛研究，涉及多种外植体类型、培养基及PGR组合。

**外植体选择**：根茎芽（rhizome bud）和萌发根茎芽的茎尖（shoot tip）是启动姜离体培养最常用的外植体；叶片、茎段及叶鞘等外植体对直接体外繁殖反应不佳。外植体大小亦为关键：较小外植体携带内生污染概率低，但易机械损伤且出芽慢；较大外植体形态建成反应快，但消毒困难、存活率降低。研究人员建议采用横向薄层细胞层（transverse thin cell layer, tTCL，约2 mm厚）技术，可在降低污染率的同时最大化外植体利用率。

**外植体表面消毒**：姜根茎芽因长期暴露于土壤病原，建立无污染培养颇具挑战。常用消毒方法包括乙醇预处理继以次氯酸钠（NaOCl）或升汞（HgCl₂），有时辅以杀菌剂或抗生素。实验室级NaOCl（0.5%–3.6%，10–20 min）可获得高无菌培养率且_phytotoxicity_较低；商业漂白剂（如Clorox^?，~5.25% NaOCl）因含稳定剂和表面活性剂，_phytotoxicity_较高，需优化浓度或添加植物防腐剂混合物（Plant Preservative Mixture, PPM）以降低伤害。HgCl₂消毒效果虽佳（无菌培养率常≥80%），但具有高毒性、_phytotoxicity_及环境危害性，正被纳米技术（如银、氧化锌纳米颗粒）和天然植物源抗菌剂等环保替代方案所取代。

**基本培养基**：全量Murashige and Skoog（MS）培养基广泛用于姜培养启动和增殖阶段；Gamborg B5、Linsmaier and Skoog（LS）、Woody Plant Medium（WPM）等亦有报道。MS培养基因其较高的大量、微量元素浓度及平衡的NH₄⁺:NO₃^?比（20.61:39.41），在'Bentong'姜增殖中优于B5培养基。生根阶段常用半量培养基以降低渗透压（osmotic pressure），促进根系发育及后续驯化；半量B5对姜根诱导效果优于全量及半量MS等。碳源通常采用蔗糖，30 g L^?1为常规浓度，但提高至60 g L^?1可增加芽和根数，过高浓度则导致渗透胁迫和根系发育不良。

**PGR效应**：细胞分裂素（cytokinin）和生长素（auxin）是直接再生的关键调节因子。常用于姜芽增殖的细胞分裂素包括6-苄基氨基嘌呤（6-benzylaminopurine, BAP）、激动素（kinetin）、噻苯隆（thidiazuron, TDZ）、玉米素（zeatin）和2-异戊烯基腺嘌呤（2-isopentenyl adenine, 2-iP）。研究表明，中等浓度BAP配合低浓度萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid, NAA）可有效促进多基因型姜的芽增殖，但最优细胞分裂素类型因基因型而异：zeatin在'Bentong'姜中优于BAP、kinetin和TDZ；而kinetin在'Yemeni'姜中更有效。细胞分裂素浓度与芽质量呈反比关系，高浓度虽增加 shoots 数但降低芽长，影响后续生根和驯化。细胞分裂素组合（如BAP+kinetin）具有协同增效作用。低浓度赤霉素（GA₃）可进一步提高增殖效率。生根方面，NAA通常比吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）和吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid, IBA）更有效诱导根系，但NAA诱导的根较短。

**试管苗驯化**：驯化是微繁殖的关键最后阶段。温湿度控制和栽培基质选择至关重要。初期覆盖透明聚乙烯薄膜以提高相对湿度、降低蒸腾；随后于温室或荫棚硬化2–3周。有机-无机复合基质（如土壤:椰糠:蛭石=1:1:1）因保水透气性好，可获得94.79%的存活率；纯泥炭苔（peat moss）在控制条件下可达100%存活。

**微根茎诱导**

微根茎诱导是姜科等根茎类植物的重要 Advanced 微繁殖技术。微根茎在解剖特征上与成熟根茎相似，含淀粉粒、油细胞和纤维。其形成受碳水化合物浓度、PGR、光周期及硝酸银（AgNO₃）添加等因素影响。蔗糖作为主要代谢信号，60–80 g L^?1浓度可最优诱导微根茎，远高于常规增殖的30 g L^?1。BAP为最常用细胞分裂素，但zeatin在'Bentong'姜中更有效，可能与其独特的稳定性和代谢特性有关：zeitan易被细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX）降解，限制了持续的细胞分化和营养芽形成，从而促进向贮藏器官发育的转换。生长素（如NAA）与蔗糖协同促进微根茎数和生物量。微根茎可直接田间种植，无需驯化，且具备预形成的贮藏器官，缩短田间建植时间，便于贮藏、运输和种质交换。

**间接体外再生**

**愈伤组织诱导与增殖**：茎尖和离体 aerial stem 外植体反应优于叶片或根；红姜中叶片鞘和茎基部优于其他组织。降低MS培养基氮含量可提高愈伤诱导和胚胎发生响应。2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D）~9 μM 为最有效的愈伤诱导剂，配合BAP或NAA可增效。生长素通过激活LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）转录因子下调cyclin-dependent kinase（CDK）抑制因子促进细胞增殖；细胞分裂素则通过type-B ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR（ARR1, ARR21）激活CYCLIN D3（CYCD3）推动细胞周期。愈伤增殖亦受基因型和PGR regime影响，picloram（33.13 μM）可促进快速稳定化；30 g L^?1蔗糖最适生物量积累。

**间接器官发生**：通过愈伤组织培养实现，较低BAP浓度（2.22–4.44 μM）更有效，配合NAA可同时促进芽和根分化。TDZ在相关姜科物种中间接器官发生效果优异，姜中系统研究尚有限。

**体细胞胚胎发生**：可分直接途径（外植体直接产生胚状体）和间接途径（经愈伤组织阶段）。生长素，特别是2,4-D，对诱导胚胎性愈伤组织至关重要；基因型差异显著，某些2,4-D与kinetin或BAP组合胚胎发生频率更高。非生物胁迫（如延长培养或干燥胁迫）是触发胚胎发生转变的关键，可重塑细胞代谢和基因表达。培养基氮源修饰（如半量NH₄NO₃）、愈伤组织结构（致密型vs. 松散型）及培养基配方（如LS优于MS）均影响胚胎发生效果。成熟阶段需降低或去除生长素，富细胞分裂素条件（BAP+低浓度NAA）促进胚状体发育和植株再生。

**细胞 biological 与遗传操作**

**细胞悬浮培养**：由松脆、黄色、含球形胚的愈伤组织建立，液体MS培养基（降氮）、26±ogene 黑暗、120 rpm持续振荡为条件。接种密度是关键：1.0%（w/v）最优，低于0.5%生长不良，高于2.0%则营养耗竭、褐变。搅拌速度影响细胞团大小：120 rpm产生0.1–0.2 mm小细胞团，适合原生质体分离；80 rpm产生1–2 mm大细胞团，利于体细胞胚胎发生和植株再生。该平台为次生代谢产物生产（如通过茉莉酸甲酯、水杨酸等 elicitors）提供潜在途径。

**原生质体分离与体细胞杂交**：以4%纤维素酶+1%离析酶+0.1%果胶酶的混合液，从胚胎性悬浮细胞分离原生质体，产量达6.27×10⁶个/g，活力良好。无碳水化合物改良液体MS培养基（含500 mg L^?1酪蛋白水解物、9%甘露醇、4.52 μM 2,4-D、0.93 μM kinetin）启动培养，2–3天启动细胞分裂；葡萄糖优于蔗糖促进微菌落形成。9周形成微愈伤，添加11.77 μM AgNO₃有效缓解褐变。4个月后体细胞胚发育，最终再生13株完整植株。

聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）介导的原生质体融合已实现姜体细胞杂交，30% PEG6000处理15分钟，二元融合率达13.5%。'Chenggu Huang Jiang'与'Sichuan Zhugen Jiang'融合组合经15个月培养再生完整植株，随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD）证实3株真杂种，流式细胞术验证染色体倍性稳定。但融合频率仍低，未来需优化电融合（electrofusion）技术以减少对原生质体的损伤。

**遗传忠实性**：直接再生通过茎尖培养保持遗传稳定性，简单序列重复区间（Inter-Simple Sequence Repeat, ISSR）、RAPD、简单序列重复（Simple Sequence Repeat, SSR）等分子标记均证实。间接再生通过愈伤组织则较易发生遗传变异：2,4-D单独或与BAP配合诱导的愈伤再生植株中检测到6.73%的多态性率；其他生长素如dicamba和picloram的效应尚待研究。

**转基因与基因编辑**：姜遗传转化研究有限，主要有两种根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导系统：幼芽外植体经体细胞胚胎发生获得稳定转化（转化率1.1%–2.2%）；叶鞘外植体经间接体细胞胚胎发生获得瞬时转化。染色体级别基因组组装为精准生物技术奠定基础：'Zhugen'姜12个酶基因家族构成的姜辣素类似物骨架生物合成途径；单倍型解析二倍体基因组识别与不育相关的染色体倒位；转录因子ZoMYB106和ZobHLH148作为6-姜辣素（6-gingerol）生物合成限速酶基因（ZoCCOMT1、ZoCCOMT2）的关键调控因子。尽管CRISPR/Cas9在姜中尚未报道，但已成为近期可行候选，优先靶点包括：编辑ZoCCOMT1/ZoCCOMT2调控网络提高6-姜辣素产量；基于与芒果姜（Curcuma amada）比较转录组学识别抗病相关候选基因和miRNA调控网络以提高对青枯病抗性；以及非生物胁迫耐受性改良。解决持续低下的转化效率是实现CRISPR/Cas9常规应用的关键前提。

**次生代谢产物生产**

体外培养系统（愈伤组织和细胞悬浮培养）为姜生物活性次生代谢产物生产提供 promising 平台。生物和非生物 elicitors 可影响代谢物合成。甲羟戊酸（mevalonic acid, 1 mg L^?1）、酵母提取物（250 mg L^?1）和黑曲霉（Aspergillus niger, 250 mg L^?1）可显著促进6-姜辣素生产（高达30 μg/100 mg愈伤鲜重），而未处理愈伤检测不到姜辣素和姜烯酚。但总体上，愈伤培养物的6-姜辣素含量（0.056%）仍低于常规栽培根茎（0.165%）。酵母提取物（100 mg L^?1）和水杨酸（50 mg L^?1）可剂量依赖性地提高总酚含量（分别达45.91和44.89 mg没食子酸当量/g）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）自由基清除活性。不同类型愈伤中棕色愈伤酚类含量最高，高渗透压诱导的愈伤褐化凸显胁迫在次生代谢合成中的作用。红姜愈伤提取物总酚含量可高于根茎提取物，但总黄酮含量显著较低，反映基因型和培养条件的差异。发根培养（hairy root culture）在其他姜科物种中已成功应用，姜中尚待探索。

**结论与未来建议**

姜具有重要的药用、营养和经济价值，但其营养繁殖特性和狭窄遗传基础限制了常规育种和大规模生产。本综述系统整合了体外再生和生物技术的最新进展，揭示虽有 meaningful progress，但基因型独立的标准化再生方案缺失、污染管理和驯化瓶颈、规模化生产的生物反应器及人工种子技术探索不足等根本局限仍待解决。新近染色体级别基因组组装为组学辅助再生研究提供基础，CRISPR/Cas9基因组编辑作为最具变革性的近期机遇，优先靶点涵盖6-姜辣素生物合成调控、细菌性萎蔫病抗性及非生物胁迫耐受性。实现该潜力关键在于解决持续低下的遗传转化效率并应对各国对基因组编辑作物的差异化监管框架。未来需协调推进标准化再生系统、胚胎发生重编程分子机制、规模化生产平台及精准基因组编辑等 interconnected 研究优先领域，以推动姜生物技术从概念验证向可持续商业应用转化。