脱铁胺与5-氨基乙酰丙酸或γ-氨基丁酸的偶联物：合成、理论研究、铁螯合能力及在人Caco-2细胞中的渗透性

《BioMetals》：Conjugates of desferrioxamine with 5-aminolevulinic or γ-aminobutyric acid: synthesis, theoretical studies, iron-chelating ability, and penetration in human Caco-2 cells

　　

铁过载 (Iron Overload, IO) 是一种对人类有害的病症，会促进DNA和脂质的氧化损伤。由于IO与神经退行性疾病 (Neurodegenerative Diseases, NDs) 的发病有关，螯合疗法已被广泛用于治疗IO，并被认为可能适用于NDs的治疗。脱铁胺 (Desferrioxamine, DFO) 对铁(III)具有高亲和力和选择性，然而，其作为螯合剂的临床应用因其低细胞渗透性而受限。为了克服这一限制，研究人员选择了将DFO与5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid, 5-ALA) 或γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 偶联的合成路线和条件，这两种非蛋白氨基酸先前被报道可渗透血脑屏障 (Blood-Brain Barrier, BBB)。获得并纯化后，偶联物5-ALA-DFO和GABA-DFO通过液相色谱-电喷雾离子化质谱 (LC/ESI-MS)、核磁共振氢谱 (¹H NMR) 和碳谱 (¹³C NMR) 进行了表征。两者均表现出与DFO相当的铁结合能力，显示出相同的抗氧化活性，与人血清白蛋白 (Human Serum Albumin, HSA) 的相互作用较弱，并且无法从转铁蛋白 (Transferrin, Tf) 中去除铁。基于密度泛函理论 (Density Functional Theory, DFT) 计算，研究人员开发了一个理论模型，可以预测DFO及其偶联物的铁螯合效率，该模型与实验结果高度一致。在人结直肠腺癌 (Human Colorectal Adenocarcinoma, Caco-2) 细胞（一种血脑屏障模型）的实验中，两种螯合剂均无毒性，并且与DFO或5-ALA-DFO不同，GABA-DFO能够结合细胞内铁。总之，这些结果表明，本文提出的化学偶联策略非常有效，并且GABA-DFO是一种有前景的细胞内铁螯合剂。

铁是生命所必需的，也是人体内最丰富的过渡金属。它作为多种生物分子的辅因子，并由于三价铁 (Fe(III)) 和二价铁 (Fe(II)) 形式之间在生物学上可及的相互转化，参与氧运输、DNA合成、抗氧化防御和电子传递链等广泛过程。铁的吸收、转运、外排和储存分别受到转铁蛋白 (Transferrin, Tf)、二价金属转运蛋白1 (Divalent Metal Transporter 1)、膜铁转运蛋白 (Ferroportin) 和铁蛋白 (Ferritin) 等蛋白质的严格调控。这些蛋白质也决定了不稳定铁池 (Labile Iron Pool, LIP) 中的胞质铁水平，LIP是细胞内活性铁的主要来源。铁过载会破坏这种平衡，通过增加活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)（如羟基自由基）的产生，并促进DNA和脂质的氧化损伤。这种状况与神经退行性疾病和癌症的发病有关。螯合疗法是铁过载的可能治疗方法之一，目前有三种螯合剂被批准用于临床：脱铁胺 (Desferrioxamine, DFO)、去铁酮 (Deferiprone, DFP) 和地拉罗司。用于治疗IO的螯合剂需满足的要求包括对金属的选择性、形成的复合物稳定性高、成本低、铁-螯合剂复合物对生物还原剂和氧化剂的反应性低、在生物靶点处吸收良好和生物利用度高等。在临床使用的螯合剂中，细菌铁载体DFO是唯一的六齿配体，形成高度稳定 (logK_FeDFO = 30.5) 且氧化还原惰性的三价铁复合物。尽管DFO对铁(III)具有高亲和力和选择性，但它是一种亲水性螯合剂，对包括血脑屏障在内的生理屏障渗透性低。鉴于DFO的这些潜在应用，研究人员已开发出新策略以增强其跨生理屏障的渗透性。本研究团队一直致力于开发DFO与能够与细胞膜和血脑屏障相互作用的分子的偶联物。受5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸能穿过血脑屏障这一事实的启发，本研究设计、合成并研究了DFO与这两种非蛋白氨基酸的偶联物，作为促进该重要生理屏障转运铁载体的可能方案。

本研究旨在通过快速高效的方案，化学合成、纯化和表征DFO与据报道可渗透生理屏障的非蛋白氨基酸的偶联物，同时尽可能避免或减少使用被美国环境保护署列为有害空气污染物的溶剂。研究人员选择了基于传统化学肽合成的路线，通过形成酰胺键合成了Boc-5-ALA-DFO和Fmoc-GABA-DFO中间体，随后在特定条件下脱除Boc或Fmoc保护基，最终得到目标偶联物5-ALA-DFO和GABA-DFO。所有产物均通过LC/ESI-MS、核磁共振、傅里叶变换红外光谱和紫外-可见光谱进行了全面表征，确认了其结构和高纯度（均>96%）。研究采用了竞争性荧光测定法（使用钙黄绿素探针）评估铁结合能力，通过铁催化抗坏血酸氧化模型（使用二氢罗丹明探针）评估抗氧化活性，利用荧光标记的脱铁转铁蛋白研究其从转铁蛋白中夺取铁的能力，并通过荧光发射和圆二色光谱分析了与人血清白蛋白的相互作用。此外，研究还基于密度泛函理论计算开发了一个理论模型，用于预测DFO及其偶联物与转铁蛋白活性中心片段相互作用的铁螯合效率。在生物学评估方面，研究使用人结直肠腺癌Caco-2细胞系（作为肠上皮屏障和血脑屏障的体外模型），通过MTT法评估了细胞毒性，并通过钙黄绿素-AM探针结合荧光显微镜观察，评估了偶联物渗透细胞并螯合细胞内铁的能力。

**合成与纯化**
研究人员成功合成了两种偶联物5-ALA-DFO和GABA-DFO，并对其进行了纯化和表征。合成路线基于传统肽合成方法，通过酰胺键形成和随后的保护基脱除步骤实现。两种偶联物均表现出高纯度，并且通过多种光谱技术确认了其预期结构。值得注意的是，5-ALA-DFO在所用分析条件下表现出酮-烯醇互变异构现象。

**钙黄绿素竞争和抗氧化实验**
竞争性实验表明，5-ALA-DFO和GABA-DFO与DFO具有相似的钙黄绿素荧光恢复曲线，表明它们保留了DFO的高铁结合能力，而游离的5-ALA或GABA则无此能力。在铁/抗坏血酸氧化模型中，GABA-DFO显示出与DFO相当的浓度依赖性抗氧化活性，而5-ALA-DFO的活性略有降低，这可能是由于其铁复合物在抗坏血酸存在下的稳定性较低或还原电位较高所致。

**与血浆蛋白转铁蛋白和人血清白蛋白的相互作用**
实验结果表明，5-ALA-DFO和GABA-DFO均无法在实验时间框架内从铁饱和的荧光标记转铁蛋白中夺取铁，这与DFO和其他已报道的DFO偶联物的行为一致。与人血清白蛋白相互作用的荧光发射和圆二色光谱分析显示，两种偶联物仅引起蛋白光谱的微小变化，表明它们与HSA的相互作用较弱，这提示其可能的药理学应用可能不依赖于HSA转运。

**铁与氨基酰基偶联物结合的理论研究**
研究人员开发了一个基于量子化学计算的理论模型，用于预测DFO及其偶联物（5-ALA-DFO、GABA-DFO和DFO-Suc-SS02）从转铁蛋白活性中心片段夺取铁的效率。计算采用密度泛函理论，并在水溶液中使用了极化连续介质模型。计算得到的归一化平衡常数表明，所有DFO偶联物都是比DFO本身更有效的铁螯合剂，这一预测与先前关于DFO-Suc-SS02具有更强铁结合能力的实验数据一致。该模型虽然简化，但可用于初步比较不同配体的螯合效率。

**细胞活力和细胞内铁结合实验**
在分化的Caco-2细胞中，5-ALA-DFO、GABA-DFO、DFO以及阳性对照SIH在测试浓度下均未显示出显著细胞毒性（细胞存活率>90%）。细胞内铁结合实验使用钙黄绿素-AM探针和铁-8-羟基喹啉复合物进行。结果显示，与不能渗透细胞的阴性对照DFO以及5-ALA-DFO不同，GABA-DFO能够显著恢复被细胞内铁淬灭的钙黄绿素荧光，其效果与阳性对照SIH相似。这表明GABA-DFO具有增强的细胞渗透性，并能有效螯合胞质铁。

在讨论部分，研究人员总结了主要发现。合成策略成功地产生了高纯度的DFO-氨基酸偶联物。生物物理和化学表征证实，偶联保留了DFO核心的铁螯合和抗氧化特性，同时改变了其物理化学性质。理论计算模型与实验数据吻合，为未来新型螯合剂的设计提供了有价值的预测工具。最关键的是，细胞实验揭示了GABA-DFO相较于DFO和5-ALA-DFO在细胞渗透性方面的优势，这归因于GABA部分的特性。研究人员指出，GABA本身已知能穿过血脑屏障，且其某些偶联物已显示出与神经系统相关的生物活性，这进一步支持了GABA-DFO作为潜在神经保护剂的潜力。然而，5-ALA-DFO未能显示出细胞渗透性，表明与DFO的偶联可能影响了5-ALA固有的跨膜能力。

**结论**
新的DFO与5-ALA和GABA的偶联物被设计、合成、纯化和表征。5-ALA-DFO和GABA-DFO以与DFO相当的亲和力结合铁，两者在铁/抗坏血酸体系中均显示出抗氧化活性，不能从转铁蛋白中去除铁，并且与人血清白蛋白的相互作用较弱。此外，计算模拟结果与已发表的实验数据一致，证实该理论量子化学模型可以成为设计新型铁螯合剂的有价值工具。两种偶联物对Caco-2细胞均无害。值得注意的是，与DFO相比，GABA-DFO显示出增强的细胞渗透性，并且能够结合Caco-2细胞内的胞质铁，这表明所采用的偶联策略可能改善了DFO的细胞渗透性。考虑到GABA-DFO作为铁螯合剂的良好特性，这项工作为利用更复杂的生物模型研究其神经保护作用开辟了可能性。