空间及多组学分析揭示周细胞来源的CCL19是中枢神经系统淋巴瘤的关键预后因子

《HemaSphere》：Spatial and multi-omic profiling reveals pericyte-derived CCL19 as a key prognostic factor in CNS lymphoma

　　

摘要：目前中枢神经系统淋巴瘤（central nervous system lymphoma, CNSL）临床异质性的生物学机制尚不清楚。既往小鼠模型研究表明趋化因子CCL19是CNSL形成的关键因子，但其在人类疾病中的作用尚不明确。本研究对82例CNSL标本进行深度遗传学与转录组学分析，发现高表达CCL19的淋巴瘤具有不同的遗传学变异及肿瘤细胞组成，且与免疫抑制及抗凋亡特征相关。CCL19水平在CNSL患者间差异显著，高CCL19表达与较差的无进展生存（progression-free survival, PFS）及总生存（overall survival, OS）显著且独立相关。空间转录组、单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）及免疫组织化学显示血管丰富区内的周细胞（pericyte）是CCL19的主要来源，CCL19与其主要受体CCR7显著共定位，而CCR7富集于浆母细胞样恶性B细胞、树突状细胞、NK细胞及CD4+T细胞中。综上，本研究确定周细胞来源的CCL19是CNSL新型预后标志物，与不良遗传学变异及向静息态肿瘤微环境偏移的免疫景观相关；空间共定位CCR7提示靶向CCL19–CCR7轴可作为未来治疗策略的方向。

原发性或继发性中枢神经系统淋巴瘤（central nervous system lymphoma, CNSL）属于局限于中枢神经系统的侵袭性大B细胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma, LBCL），虽含甲氨蝶呤为基础的治疗使部分患者获得缓解，但仍有一大部分患者出现疾病进展或复发且预后极差。CNSL临床异质性的分子与免疫学机制尚未阐明。既往小鼠模型提示星形胶质细胞来源的CCL19可介导恶性B细胞在脑实质滞留并促进CNSL形成，但CCL19在人类CNSL微环境（lymphoma microenvironment, LME）中的生物学作用及临床意义未得到探究。为此，研究人员对82例CNSL标本开展整合空间及多组学分析，旨在明确CCL19的细胞与空间来源、对LME及免疫景观的影响、预后价值及其与临床病理特征的关联，最终发现血管区周细胞是CCL19主要来源，高CCL19表达与不良预后、免疫抑制及抗凋亡特征相关，CCL19–CCR7（C-C chemokine receptor type 7）轴在空间上共定位，提示其可作为潜在治疗靶点。该论文发表于《HemaSphere》。

主要关键技术方法

研究人员收集德国弗莱堡与慕尼黑医学中心92例患者（CNSL n=82：原发CNSL即primary CNSL/PCNSL n=70，继发CNSL即secondary CNSL/SCNSL n=12；胶质母细胞瘤glioblastoma, GBM n=10对照）的肿瘤标本。主要技术方法包括：① 福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）或新鲜冰冻组织bulk RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq）并用CIBERSORTx反卷积估算细胞组成，Lymphoma EcoTyper定义淋巴瘤生态型；② 肿瘤DNA行靶向捕获测序（Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing, CAPP-Seq）结合浅全基因组测序（shallow whole-genome sequencing, sWGS）做拷贝数变异（copy number variation, CNV）分析及LymphGen分型；③ 10例新鲜冰冻组织行单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq，10x Chromium平台，Seurat 5.1分析）；④ 9例肿瘤行10x Visium空间转录组（spatial transcriptomics），由神经病理学家标注富血管（vessel-rich）与贫血管（vessel-poor）区并用SPATA2分析；⑤ 多重荧光免疫组织化学（fluorescent immunohistochemistry, mIHC）验证CCL19与周细胞标记物血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor, PDGFR）α/β共定位；⑥ 采用Kaplan–Meier法、log-rank检验及Cox比例风险回归模型评估生存意义。

CCL19 expression in CNSL and its prognostic relevance（CNSL中CCL19表达及其预后相关性）

研究人员通过bulk RNA-seq检测82例CNSL标本，发现CCL19表达水平个体差异极大（13%无检出），且显著高于GBM但低于系统性弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL，TCGA队列）。按中位数分为CCL19高/低两组，两组基线临床病理特征平衡，但CCL19高组患者年龄较年轻（中位64岁vs 71岁）。在接受治愈意向免疫化疗的患者（n=71）中，高CCL19组PFS（HR=2.49, P=0.008）与OS（HR=2.43, P=0.04）均显著更差；多变量Cox回归校正已知危险因素后CCL19高表达仍独立预示不良PFS（P=0.006）与OS（P=0.03），在完成巩固治疗亚组中预后差异更为显著（PFS HR=5.1, OS HR=4.9）。系统DLBCL中未见此预后效应。结论：CNSL中CCL19高表达是独立不良预后因子。

Association of CCL19 with molecular profiles and immune cell landscapes（CCL19与分子谱及免疫细胞景观的关联）

sWGS显示CCL19高组特有6p21.3（HLA位点）缺失、1p36（TP73）缺失及18q21（BCL2）获得，提示免疫逃逸倾向及抗凋亡；CCL19低组CDKN2A/B缺失更常见。CAPP-Seq突变谱及LymphGen亚型在两组间无显著差异。RNA-seq差异表达分析示CCL19高组上调SIGLEC15（髓系免疫抑制分子）、TMEM119、LILRA4及基质重塑基因（MMP9等）；基因集富集分析示CCL19低组富集凋亡及抗原提呈相关基因。CIBERSORTx反卷积示CCL19高组静息态巨噬细胞、NK及CD4⁺记忆T细胞相对增多。结论：高CCL19与免疫抑制、抗凋亡及"冷"微环境特征相关，可能介导治疗抵抗。

Pericytes constitute the primary source of CCL19 in CNSL（周细胞是CNSL中CCL19的主要来源）

空间转录组显示CCL19信号富集于H&E图像判定之富血管区，沿从血管区至非血管区的轨迹CCL19表达递减（bootstrap P=0.0005）。snRNA-seq对205,000个细胞核分群后，CCL19主要表达于基质/血管细胞群，进一步定位于血管周细胞（pericyte，标记基因为PDGFRB/MCAM等），内皮细胞、癌相关成纤维细胞均无表达。mIHC证实平均92% CCL19⁺细胞共表达周细胞标记物PDGFRα/β，不与CD20⁺B细胞、CD3⁺T细胞、GFAP⁺星形胶质细胞或CD31⁺内皮细胞共标。结论：CNSL中CCL19主要由富血管区周细胞分泌。

Co-localization of CCL19 and CCR7 in CNSL（CCL19与CCR7在CNSL中的共定位）

CCR7在CNSL中表达高于GBM低于系统DLBCL，snRNA-seq示CCR7高表达于树突状细胞（dendritic cell, DC）、NK细胞、CD4⁺T细胞及部分B细胞亚群；B细胞再分群发现浆母细胞样（plasmablast-like, CD38⁺）恶性B细胞高表达CCR7。空间转录组显示CCL19与CCR7显著共定位（P=0.001），即周细胞源性CCL19作用于邻近表达CCR7的恶性B细胞及其他免疫细胞。结论：CCL19–CCR7轴在CNSL血管区空间共定位，可能参与恶性B细胞滞留及三级淋巴样结构形成。

讨论与结论

研究人员首次在人CNSL中鉴定周细胞为CCL19主要来源，并证实高CCL19表达是独立于传统危险因素的不良预后标志物。高CCL19肿瘤伴HLA缺失、TP73及BCL2拷贝数异常、SIGLEC15上调及静息免疫细胞富集，提示微环境向免疫抑制与抗凋亡偏移。CCL19–CCR7空间共定位支持该轴可能促进恶性B细胞脑实质滞留及三级淋巴样结构形成。与小鼠模型中星形胶质细胞来源不同，人CNSL中CCL19源自周细胞，这一差异凸显物种与微环境特异性。现有CCR7靶向药物（如抗CCR7抗体CAP-100、抗体偶联药物JBH492）在系统非霍奇金淋巴瘤中进行Ⅰ期试验，但未纳入CNS受累患者，本研究为将来在CNSL中探索靶向CCL19–CCR7轴提供依据。

原文结论翻译：本研究确定CNSL血管区周细胞来源的CCL19是不良预后因子，与不利遗传学改变及免疫微环境静息化相关；CCL19与其受体CCR7空间共定位，提示CCL19–CCR7轴是CNSL发生与存活的重要因子，可作为脑淋巴瘤潜在治疗靶点。