RNA解旋酶DDX6通过液-液相分离调控炎症小体激活过程中P小体内ASC斑点形成及其向应激颗粒的转换

《Cell Discovery》：RNA helicase DDX6 governs ASC speck formation in P-bodies and the transition to stress granules via phase separation during inflammasome activation

　　

凋亡相关点状蛋白含CARD（ASC）的募集与凝聚对于ASC斑点形成及炎症小体激活至关重要，然而该过程在细胞内高效发生的机制尚不明确。研究人员通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）分析鉴定出RNA解旋酶DDX6为ASC相互作用蛋白。DDX6通过其RNA解旋酶活性促进ASC向NLRP3和AIM2受体的募集，从而激活这两种炎症小体。机制上，DDX6作为加工体（P-body）组装的支架蛋白，通过液-液相分离（LLPS）驱动P小(pearson)体内ASC斑点形成。研究表明膜完整性与应激颗粒（SG）形成相关，在Caspase-1^–/、Gsdmd^–/或NINJ1抑制细胞中，DDX6介导炎症小体激活过程中ASC斑点在P小体内的初始组装，继而向SG转换。巨噬细胞中DDX6缺失增加宿主对李斯特菌感染的易感性。研究结果确立DDX6通过LLPS介导的机制协调ASC募集、斑点形成及后续转换，为炎症小体组装及相关疾病的治疗提供新见解。

炎症小体（inflammasome）是细胞质中的超分子复合物，作为先天免疫系统应对病原体和损伤相关刺激的关键调节因子。炎症小体激活受到严格调控，因其失控激活可导致包括自身炎症性、神经退行性、感染性和心血管疾病在内的多种罕见遗传综合征。典型炎症小体如NLRP3和AIM2炎症小体的组装始于感受器蛋白（NLRP3或AIM2）的寡聚化，随后依次招募接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1。冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构分析揭示，圆盘状活性NLRP3寡聚体暴露PYD丝状结构，形成NLRP3^PYD成核种子，这些种子招募ASC，促进PYD丝延伸和ASC斑点形成。然而，从NLRP3成核种子到ASC丝延伸的在体转换机制仍不清楚。

蛋白质相分离，即生物分子凝聚，是通过蛋白质、核酸及其他生物分子的超分子组装形成无膜细胞器的基础物理过程。P小体（PBs）和应激颗粒（SGs）是通过蛋白质和RNA相分离形成的动态细胞内凝聚物，介导mRNA翻译抑制。DEAD/H-box RNA解旋酶是一类ATP依赖性RNA结合蛋白，对ATP和RNA表现出高度协同性结合。DDX6是其中关键成员，作为P小体组装和多种条件下应激颗粒生物发生的全局调节因子。除结构作用外，DDX6还通过抑制靶mRNA翻译和维持P小体稳态来调节细胞可塑性。在炎症小体激活过程中，DDX3X和DHX33被鉴定为NLRP3结合蛋白，将胞质RNA感知与NLRP3炎症小体组装联系起来。尽管RNA和RNA解旋酶对多种炎症小体的激活至关重要，但P小体及其支架蛋白——特别是RNA解旋酶介导的相分离——对ASC斑点形成及后续炎症小体激活的具体贡献仍知之甚少。

研究人员鉴定DDX6为ASC相互作用蛋白，其结合ASC的PYD结构域，促进ASC与炎症小体受体NLRP3和AIM2的协同募集。DDX6缺失损害NLRP3和AIM2炎症小体激活，削弱宿主对李斯特菌感染的防御。机制上，DDX6作为P小体组装的支架蛋白，在炎症小体激活过程中通过液-液相分离（LLPS）促进ASC向成核种子的募集及斑点形成。DDX6的ATP酶活性对该相分离、P小体形成及后续ASC斑点组装至关重要。值得关注的是，在缺乏caspase-1、GSDMD或NINJ1的细胞中，DDX6介导炎症小体激活时ASC斑点向SG的转移，DDX6-ASC在P小体和SG中以互斥方式定位。这些发现共同证明DDX6通过LLPS驱动的凝聚作用协调ASC斑点形成和转换，突显其在炎症小体调节中的关键作用。

研究人员首先通过ASC免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）分析，在野生型和Asc^–/–骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中鉴定DDX6为ASC相互作用蛋白，NLRP3激活采用LPS加ATP刺激，AIM2激活采用弗朗西斯菌新杀手（Francisella novicida）感染。DDX6因已确立的作为相分离P小体组装全局调节因子的角色而成为关键候选蛋白。免疫共沉淀（co-IP）实验证实ASC与DDX6的相互作用，进一步定位显示ASC的PYD结构域和DDX6的Domain 1介导该相互作用。在野生型BMDMs中，内源性co-IP证实NLRP3（LPS加ATP）或AIM2（dsDNA转染）炎症小体激活后ASC与DDX6发生相互作用。

为评估DDX6表达与感染性疾病状态的关联，研究人员分析了来自284名健康供体和125名败血症患者的外周血单个核细胞（PBMCs）和单细胞的RNA测序源数据。值得注意的是，健康个体PBMCs和单细胞中的DDX6表达显著高于败血症患者。为考察疾病进展过程中DDX6表达的细胞类型特异性模式，研究人员进一步分析了来自轻中度（n=3）和重症（n=4）COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）的已发表单细胞RNA测序数据集，共11,482个细胞。经批次效应校正后，基于标志基因表达鉴定出六个主要细胞群体（髓系细胞、NK细胞、T细胞、上皮细胞、B细胞和浆细胞），跨越15个不同簇。与轻中度病例相比，重症病例中DDX6表达在髓系和NK细胞中降低最为显著，但T细胞中无此现象。这些发现提示DDX6这一ASC相互作用蛋白可能发挥宿主抗病原感染正向调节因子的功能。

为探究DDX6在炎症小体调节中的作用，研究人员通过将Ddx6^fl/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，构建了髓系特异性DDX6敲除小鼠。流式细胞术显示cDdx6^–/–与Ddx6^+/+小鼠中CD11b⁺F4/80⁺ BMDMs和CD11c⁺F4/80⁺肺泡巨噬细胞频率相当，表明DDX6缺失不影响巨噬细胞发育。研究人员用典型NLRP3和AIM2激动剂及相关病原体刺激BMDMs，结果显示Ddx6缺陷细胞中切割型caspase-1、成熟GSDMD-N、炎症小体依赖性细胞因子IL-1β释放以及膜破裂标志物乳酸脱氢酶（LDH）泄漏均显著减少。实时细胞死亡实验证实DDX6缺失在上述条件下对细胞焦亡具有保护作用。相反，炎症小体非依赖性细胞因子IL-6和TNF的产生无变化，且沙门氏菌鼠伤寒血清型激活NLRC4炎症小体不受DDX6缺失影响。因此，DDX6选择性促进NLRP3和AIM2介导的炎症小体激活及后续细胞焦亡。

炎症小体激活触发含ASC、感受器蛋白（NLRP3或AIM2）和pro-caspase-1的不溶性复合物组装。为确定DDX6必需的步骤，研究人员将刺激的cDdx6^–/–和Ddx6^+/+ BMDMs裂解物分为可溶性和不溶性（沉淀）组分。LPS单独处理诱导NLRP3但不诱导ASC或caspase-1进入沉淀组分，而LPS加尼日利亚菌素（nigericin）将NLRP3、ASC和caspase-1均招募至野生型细胞的不溶性组分。DDX6缺失显著减少这三种蛋白在沉淀中的回收。类似地，dsDNA转染（AIM2激活）驱动AIM2、ASC和caspase-1进入野生型BMDMs的沉淀组分，该聚集作用在DDX6缺陷细胞中受损。此外，内源性co-IP揭示在野生型而非Nlrp3^–/–Aim2^–/–（DKO）BMDMs中，NLRP3或AIM2炎症小体激活后ASC与DDX6发生相互作用。抗ASC抗体co-IP证实NLRP3或AIM2激活后DDX6缺陷BMDMs中ASC与caspase-1、DDX6以及NLRP3或AIM2的相互作用减弱。共聚焦显微镜显示DDX6与NLRP3和AIM2共定位，且DDX6缺陷细胞中NLRP3或AIM2炎症小体激活时ASC斑点形成减少。这些结果表明DDX6可能调节ASC向上游NLRP3或AIM2成核种子的募集，以促进ASC斑点形成。

DDX6的ATP酶活性对P小体和应激颗粒动力学是必需的，包括P小体形成、SG生物发生以及P小体与SG的分离。为评估其对炎症小体激活的必要性，研究人员用DEAD-box RNA解旋酶抑制剂CR-1-31-B处理BMDMs。该抑制剂确实减少了野生型BMDMs中NLRP3和AIM2炎症小体激活剂触发的caspase-1激活，但不影响沙门氏菌感染。研究人员进一步用慢病毒将野生型DDX6、催化失活点突变体DDX6^E247Q和DDX6^R386E以及随机对照点突变体DDX6^G34R转导至DDX6缺陷BMDMs。与野生型DDX6和对照DDX6^G34R转导的BMDMs相比，催化失活突变体DDX6^E247Q和DDX6^R386E转导的BMDMs在NLRP3和AIM2炎症小体激活剂刺激下caspase-1激活减少。此外，NLRP3和AIM2炎症小体激活后，DDX6^E247Q和DDX6^R386E转导/auxiliary=BMDMs中ASC与DDX6的相互作用减弱，而野生型DDX6或对照DDX6^G34R转导细胞中未出现此现象。与此一致，与野生型DDX6或对照DDX6^G34R转导的BMDMs相比，DDX6^E247Q和DDX6^R386E转导的细胞中ASC与caspase-1以及上游感受器NLRP3和AIM2的相互作用也受到抑制。这些数据共同确立DDX6利用其RNA解旋酶活性将ASC招募至NLRP3和AIM2平台，从而实现ASC斑点组装和炎症小体激活。

研究人员进一步考察ASC斑点与P小体和SGs的空间关系。NLRP3炎症小体刺激（LPS加尼日利亚菌素）后，ASC斑点在野生型、Caspase-1^–/–和Gsdmd^–/– BMDMs中形成，但在Nlrp3^–/–Aim2^–/–和Asc^–/–细胞中缺失，证实斑点形成依赖于感受器和ASC本身，而非下游caspase-1或GSDMD。在野生型BMDMs中，81.4%的ASC斑点在尼日利亚菌素处理后20-30分钟与EDC4阳性P小体共定位。在Caspase-1^–/–细胞中，ASC斑点与EDC4阳性P小体共定位的比例从52.8%降至8.3%（20至30分钟间），而与G3BP1阳性SG共定位的比例从29.3%升至77.7%。Gsdmd^–/– BMDMs中观察到类似的时间转换：ASC斑点从EDC4阳性P小体（30分钟时61.7%）转移至G3BP1阳性SG（60分钟时78.7%）。Gsdmd^–/– BMDMs中G3BP1阳性点还与另一应激颗粒标志物ATXN2L共定位。内源性co-IP分析显示，在Gsdmd^–/– BMDMs中，含ASC、DDX6、NLRP3和NEK7的复合物在处理后30分钟和60分钟优先与EDC4和G3BP1相互作用。这些结果表明，在缺乏caspase-1或GSDMD时，ASC斑点与DDX6及炎症小体受体一起起源于P小体，随后在炎症小体激活过程中重新定位于SGs。

为验证膜完整性是否调控SG形成，研究人员用甘氨酸处理野生型BMDMs，甘氨酸可阻断细胞焦亡、凋亡后裂解和坏死性凋亡过程中的NINJ1依赖性质膜破裂。甘氨酸在野生型细胞中诱导G3BP1阳性SG形成，LPS加尼日利亚菌素处理后30分钟时58.6%的ASC斑点与SG共定位，29.4%与P小体共定位。甘氨酸处理不影响IL-1β释放、caspase-1和GSDMD切割或死亡动力学，但抑制LPS本加尼日利亚菌素触发的LDH释放。电子显微镜显示对照组而非甘氨酸处理组BMDMs在LPS加尼日利亚菌素响应中出现大膜孔。因此，膜完整性的维持与SG形成相关，并促进炎症小体激活过程中ASC斑点从P小体向SGs的转换。

研究人员进一步确定DDX6是否控制炎症小体激活时P小体中的ASC斑点形成。DDX6缺失细胞中EDC4阳性P小体在基础或刺激条件下几乎检测不到，而敲除细胞中G3BP1阳性SG在炎症小体诱导时自发形成。将野生型DDX6或催化失活突变体DDX6^E247Q和DDX6^R386E转导至DDX6缺陷BMDMs后，仅野生型DDX6恢复EDC4点数量并抑制异常G3BP1点形成。野生型DDX6与EDC4点共定位，但突变体DDX6^E247Q和DDX6^R386E未能在SGs中积累，表明解旋酶活性对DDX6点形成、P小体组装及向SGs的招募是必需的。在焦亡通路功能完整和缺陷细胞中，短暂暴露于NLRP3或AIM2刺激后，DDX6主要在野生型和Gsdmd^–/– BMDMs中与EDC4共定位，但在Nlrp3^–/–Aim2^–/–、Asc^–/–和Caspase-1^–/–细胞中与G3BP1共定位。延长刺激促使Gsdmd^–/– BMDMs中DDX6从EDC4转换为G3BP1点。Co-IP分析进一步证实，炎症小体激活期间野生型DDX6在野生型BMDMs中与EDC4相互作用，在Asc^–/– BMDMs中与G3BP1相互作用，而DDX6^E247Q和DDX6^R386E则不能。这些结果共同显示DDX6通过维持P小体组装实现ASC斑点形成，并在焦亡被阻断时驱动ASC斑点在炎症小体激活过程中向SGs的后续重新定位。

DEAD-box RNA解旋酶是相分离无膜细胞器如P小体和SGs的全局调节因子。利用IUPRED2预测DDX6在其N端（残基1-90）含有固有无序区域（IDR），提示其相分离潜力。通过将DDX6的IDR、Domain 1和Domain 2与mCher-Cry2融合进行optoDroplet实验，仅mCherry-Cry3-IDR融合蛋白在蓝光照射后表现出快速依赖性聚集和点形成，表明DDX6的IDR对LLPS至关重要。为确定全长DDX6是否发生相分离，研究人员纯化了重组GFP-DDX6。在RNA和ATP存在下，GFP-DDX6在高蛋白浓度（高达20μM）时形成球形液滴，而高盐浓度（300mM）显著抑制液滴形成。使用Alexa Fluor 594标记的polyU RNA，研究人员证实RNA是GFP-DDX6液滴形成所必需的，因为GFP-DDX6与polyU-AF594完全共定位。荧光恢复后光漂白（FRAP）分析揭示野生型DDX6液滴快速恢复，而解旋酶缺陷突变体DDX6^E247Q或DDX6^R386E则否，表明RNA解旋酶活性对高效LLPS至关重要。

为研究DDX6是否通过相分离招募ASC，研究人员纯化了mCherry-ASC^PYD和mCherry-ASC^CARD融合蛋白。与GFP-DDX6不同，它们在溶液中自发形成具有丝状结构的不规则聚集体。FRAP实验显示mCherry-ASC^PYD或mCherry-ASC^CARD聚集体无荧光恢复。延时成像揭示mCherry-ASC^PYD而非mCherry-ASC^CARD与大部分GFP-DDX6液滴共定位。此外，DDX6突变体DDX6^E247Q和DDX6^R386E未能招募mCherry-ASC^PYD。光漂白后，GFP-DDX6凝聚物内的mCherry-ASC^PYD快速恢复。

为评估DDX6是否在细胞中驱动LLPS和ASC斑点形成，研究人员将GFP-DDX6质粒有或无mCherry-ASC质粒转染至HEK293T细胞，随后进行尼日利亚菌素刺激和FRAP分析。活细胞成像显示GFP-DDX6凝聚物在漂白后60秒内恢复60%的初始荧光，确认其液体样特性。在共表达GFP-DDX6、mCherry-ASC、NLRP3和caspase-1的细胞中，尼日利亚菌素诱导形成与GFP-DDX6点共定位的ASC斑点。此外，GFP-DDX6加速mCherry-ASC在光漂白后的凝聚。为验证DDX6在炎症小体组装中的作用，研究人员在HEK293T细胞中通过共表达V5-ASC、Flag-NLRP3和Flag-caspase-1有或无Flag-DDX6来重建NLRP3炎症小体。尼日利亚菌素处理后，DDX6对caspase-1的激活被LLPS破坏剂1,6-己二醇（1,6-HD）显著抑制，但不被其无活性类似物2,5-己二醇（2,5-HD）抑制。一致地，1,6-HD（而非2,5-HD）溶解了DDX6点和ASC斑点。这些发现共同证明DDX6通过LLPS促进ASC区室化以促进炎症小体组装。

为评估DDX6在细菌感染防御中的作用，研究人员考察了其在单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染中的角色，该菌可同时触发NLRP3和Aim2炎症小体活性。共聚焦显微镜显示DDX6缺失破坏P小体组装并在李斯特菌感染、LPS处理、尼日利亚菌素处理或dsDNA转染时诱导SG形成，而野生型BMDMs中DDX6与EDC4（P小体标志物）共定位。

研究人员腹腔感染Lyz2-Cre表达Ddx6^fl/fl小鼠和同窝Ddx6^+/+小鼠致死剂量单核细胞增多性李斯特菌（6.0×10? CFU）。第5天时，Ddx6^fl/fl小鼠体重下降更多（78.9% vs. 84.8%），且第6天全部死亡，而20%的Ddx6^+/+小鼠存活超过第10天。与Ddx6^+/+小鼠相比，Ddx6^fl/fl小鼠脾脏、肝脏和大脑中细菌负荷显著更高，Ddx6^+/+小鼠脑的感染极少，突显DDX6在防止神经侵袭中的重要性。与炎症小体激活受损一致，Ddx6^fl/fl肝脏中caspase-1切割减少，血清IL-1β水平降低。相反，Ddx6^fl/fl小鼠产生更高水平的IL-6和TNF，可能由于不受控制的细菌增殖。组织病理学显示Ddx6^fl/fl肝脏、脾脏和大脑中免疫细胞浸润加剧。总之，DDX6通过相分离招募ASC促进ASC斑点组装和炎症小体激活，这一机制对其在李斯特菌感染宿主防御中的作用至关重要。

在讨论部分，研究人员总结了DDX6作为ASC相互作用蛋白的核心发现：DDX6结合ASC的PYD结构域，促进ASC与炎症小体受体NLRP3和AIM2的协同募集；DDX6缺失损害NLRP3和AIM2炎症小体激活，削弱宿主对李斯特菌感染的防御；DDX6作为P小体组装的支架蛋白，通过LLPS驱动炎症小体激活时ASC斑点在P小体内的形成；DDX6的ATP酶活性对该相分离、P小体形成及后续ASC斑点组装至关重要；在缺乏caspase-1、GSDMD或NINJ1的细胞中，DDX6介导ASC斑点向SG的转移，DDX6-ASC在P小体和SG中以互斥方式定位。这些发现共同证明DDX6通过LLPS驱动的凝聚作用协调ASC斑点形成和转换，为炎症小体组装及相关疾病的治疗提供新见解。

研究结论指出，DDX6通过LLPS介导的机制协调ASC募集、斑点形成及后续转换。具体而言，DDX6作为P小体组装的支架蛋白，通过其RNA解旋酶活性驱动的液-液相分离促进ASC向NLRP3和AIM2受体的募集，从而形成ASC斑点；在膜完整性得以维持（即caspase-1、GSDMD或NINJ1功能缺失）的条件下，DDX6介导ASC斑点从P小体向应激颗粒的动态转换；DDX6缺失导致巨噬细胞炎症小体激活障碍，增加宿主对李斯特菌感染的易感性。该研究确立了RNA解旋酶介导的相分离在炎症小体调控中的核心作用，为开发炎症小体相关疾病的治疗策略提供了新的分子靶点和理论基础。