骨靶向LNP递送抗硬化蛋白抗体mRNA用于骨质疏松症治疗

《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Engineering Bone-Targeted LNP Delivery of Anti-Sclerostin Antibody mRNA for the Treatment of Osteoporosis

**摘要**
信使RNA（mRNA）疗法代表了再生医学领域的一个变革性平台，但其在骨骼疾病中的应用仍受限于传统脂质纳米颗粒（LNP）递送系统显著的肝脏趋向性。为了将生物分子重新定向至骨组织，研究人员通过微流控合成及随后的Asp8肽（与羟基磷灰石结合）表面偶联，开发了一种骨靶向mRNA纳米载体（SA@LNP-D）。该系统能够在骨组织中高效表达抗硬化蛋白抗体mRNA，从而为骨质疏松症治疗实现疗效。体外实验结果表明，经骨靶向肽修饰的LNP表现出显著的骨亲和力，并能高效结合羟基磷灰石和离体骨组织。此外，体内结果证实，SA@LNP-D有效减少了肝脏截留，并通过矿物定向锚定特异性积累于骨骼。在小鼠卵巢切除（OVX）骨质疏松症模型中，与常规LNP相比，全身递送骨靶向LNP表现出更强的治疗效果。它不仅刺激骨形成，还抑制骨吸收，从而显著恢复骨小梁骨量和微结构。总之，这项工作建立了一种靶向、非肝脏的mRNA递送策略，为骨质疏松症及相关骨骼疾病提供了一种安全有效的治疗选择。

**论文解读**

**研究背景**
骨质疏松症是一种以骨量和骨微结构系统性损害为特征的疾病，已成为日益严重的全球健康危机，尤其在老年人群中。其导致的脆性骨折带来了沉重的经济负担，并显著降低了患者的生活质量。目前的一线药物治疗主要包括抗骨吸收药物（如双膦酸盐）或促骨形成药物（如甲状旁腺激素类似物）。在众多新兴治疗靶点中，硬化蛋白（sclerostin， Sost）作为一种分泌型糖蛋白，通过负向调节对成骨至关重要的Wnt/β-catenin信号通路而备受关注。尽管针对Sost的单克隆抗体疗法（如Romosozumab）已显示出强大的骨形成能力，但其临床应用常受限于潜在的全身性副作用（尤其是心血管风险）以及与重组蛋白生产和纯化相关的高昂成本。因此，如何在维持疗效的同时最小化全身暴露，仍是骨再生医学领域需要克服的关键挑战。

近年来，信使RNA（mRNA）疗法为现代医学带来了范式转变。其核心概念是利用患者自身的细胞作为蛋白质生产机器来生成治疗性蛋白。与重组蛋白相比，mRNA药物具有开发周期短、具备持续细胞内表达潜力等优势。脂质纳米颗粒（LNP）是目前临床上最先进的mRNA递送载体。然而，基于LNP的mRNA疗法在全身给药后往往倾向于在肝脏（肝脏趋向性）积累。全身给药LNP的主要肝脏摄取阻碍了其用于靶向肝外组织。克服这一瓶颈，实现对骨微环境等难以触及组织的精准递送，是将mRNA技术应用于骨骼疾病的关键需求。

为了应对这一递送障碍，利用骨骼独特的矿物质成分为解决之道提供了希望。骨组织富含羟基磷灰石（hydroxyapatite， HA），这是一种结晶态的磷酸钙形式。带负电荷的寡肽，如聚天冬氨酸（例如Asp8），对HA表面存在的钙离子（Ca²⁺）具有高结合亲和力。虽然这种对骨矿物成分的亲和力已在小分子递送中得到探索，并最近扩展到一些核酸载体，但实现高效、特异的mRNA向骨微环境的递送仍是一个重大挑战。

**研究方法**
为开发针对骨组织的高效mRNA递送平台，研究人员利用微流控技术合成了LNP及其骨靶向衍生物（LNP-D）。通过将骨靶向Asp8肽与DSPE-PEG（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）偶联，构建了骨靶向LNP-D。研究采用了多种体外、离体和体内模型来评估该系统的性能。体外评估包括使用羟基磷灰石包被的酶联免疫吸附测定（ELISA）板、非脱钙骨组织切片和离体小鼠股骨进行骨亲和力测试；通过转染人胚胎肾293T（HEK293T）细胞评估mRNA转染能力和细胞毒性。体内研究则通过尾静脉注射封装了荧光素酶（luciferase）mRNA的LNP，利用活体成像系统（IVIS）观察主要器官的生物发光信号分布，以评估体内靶向性。治疗研究采用8周龄雌性C57BL/6小鼠，通过双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型，建模成功后随机分组，分别接受PBS、非靶向SA@LNP或骨靶向SA@LNP-D的尾静脉注射治疗。疗效评估通过显微计算机断层扫描（micro-CT）在治疗后4周和8周进行，分析骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度等参数。组织学分析包括对脱钙股骨切片进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、骨钙素（OCN）免疫荧光组化染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，以评估骨形成和骨吸收的细胞学变化。生物安全性评估则包括对主要器官进行H&E染色病理学检查以及检测血清肝肾功能指标。

**研究结果**

**2.1 骨靶向LNP-D的制备与表征**
微流控技术成功合成了LNP和LNP-D。质子核磁共振（¹H NMR）证实了骨靶向Asp8肽与DSPE-PEG的成功偶联。透射电子显微镜（TEM）显示LNP和LNP-D均呈典型的球形形态，单分散性高，直径约为100 nm。表面修饰Asp8肽后，LNP-D的Zeta电位变为-3.29 mV，而未修饰的LNP为1.70 mV，这归因于天冬氨酸残基的负电性。动态光散射（DLS）测定两者流体动力学直径均约为93 nm，多分散指数（PDI）值低，表明粒径分布接近单分散。两种纳米颗粒的mRNA封装效率均高达90%。在HEK-293T细胞中的转染实验表明，LNP-D保持了与LNP相当的高转染效率（约84% vs 90%），且细胞毒性相似，证明Asp8表面修饰并未损害LNP平台的高转染能力。

**2.2 体外和离体实验中LNP-D的骨亲和力增强**
使用HA包被的ELISA板进行的结合实验显示，DiR标记的LNP-D对板底表现出显著的结合，而LNP和PBS对照组信号可忽略，表明骨靶向LNP对羟基磷灰石具有高亲和力。离体结合实验进一步证实了这一点：使用非脱钙骨组织切片，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到DiR标记的LNP-D在骨皮质表面有明显的红色荧光信号定位，而未修饰的LNP则无特异性结合。使用离体小鼠股骨进行的实验也显示，LNP-D组在整个股骨表面有强烈的荧光积累，而LNP和PBS组仅显示微弱的背景荧光。这些结果共同证明，Asp8修饰成功地将LNP转化为骨靶向递送系统。

**2.3 LNP-D的体内生物分布与骨特异性靶向**
体内靶向性验证实验显示，尾静脉注射封装了荧光素酶mRNA的纳米颗粒后，离体主要器官生物发光成像揭示了不同的分布模式。未修饰的luc@LNP组生物发光信号主要集中于肝脏，骨骼中积累可忽略。相比之下，luc@LNP-D组的生物分布模式发生显著改变，在脾脏和骨骼中均显示出强信号，表明组织特异性被显著重定向。对生物发光强度的定量分析进一步证实，luc@LNP-D组骨组织中的荧光素酶表达量相比luc@LNP组有统计学意义的显著增强。这些结果表明，该修饰成功提高了LNP在体内向骨骼系统的递送效率。

**2.4 负载抗Sost抗体mRNA的骨靶向LNP的体外功能验证**
研究评估了递送的抗硬化蛋白抗体（SA）mRNA的功能生物活性。转染SA@LNP-D的HEK293T细胞成功表达并分泌了抗硬化蛋白抗体，免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）分析均证实了这一点。抗体分泌量呈剂量依赖性增加。通过硬化蛋白结合ELISA证实，细胞上清液中的抗体能特异性、高亲和力地结合硬化蛋白蛋白。使用荧光素酶报告系统评估Wnt信号激活，结果显示分泌的抗体能显著减轻硬化蛋白诱导的Wnt通路抑制，证明其具有功能生物活性。将转染细胞上清液用于MC3T3-E1细胞的成骨诱导实验，结果显示抗体显著减轻了Sost对成骨的抑制作用，碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节定量与仅含Wnt的组无显著差异。这些结果表明SA@LNP-D能产生具有功能的抗硬化蛋白抗体，有效中和硬化蛋白并恢复促成骨的Wnt信号微环境。

**2.5 SA@LNP-D治疗逆转骨质疏松小鼠的骨丢失**
在OVX骨质疏松症小鼠模型中评估骨靶向mRNA平台的治疗潜力。治疗后4周和8周的显微CT分析显示，与PBS组相比，SA@LNP-D治疗组股骨骨小梁微结构得到显著改善。定量形态学分析证实，SA@LNP-D治疗显著增加了骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV），表明整体骨量得到有力恢复。在微结构层面，SA@LNP-D组表现出显著更大的骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N），以及显著降低的骨小梁分离度（Tb.Sp），反映了骨质疏松性空腔被成功填充，形成了更致密、更互连的生物力学网络。治疗8周后，SA@LNP-D组在所有成骨参数上持续获得最高评分，且Tb.Sp值最低，表明该靶向疗法不仅促进骨矿物质积累，还有助于修复受损的三维骨小梁网络。这些结果证明，Asp8修饰提供的骨靶向能力对于最大化抗Sost mRNA的治疗潜力至关重要，能够有效逆转已形成的骨丢失并恢复骨骼微结构。

**2.6 增强成骨和抑制破骨的组织学证据**
组织学和形态计量学分析进一步阐明了骨量恢复的细胞机制。H&E染色和Masson三色染色显示，SA@LNP-D治疗组的骨小梁比PBS组和非靶向SA@LNP组更厚、连接性更好。骨钙素（OCN）免疫荧光组化染色显示，SA@LNP-D治疗小鼠骨表面活跃的成骨细胞数量显著增加，表明骨形成受到强烈刺激。同时，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色用于可视化负责骨吸收的破骨细胞。定量分析表明，与PBS和SA@LNP组相比，SA@LNP-D组不仅促进成骨，还显著抑制了破骨细胞的形成和活性。这些组织学结果表明，SA@LNP-D疗法增强了对骨重塑的双重调节：不仅通过中和Sost和激活Wnt通路促进成骨细胞骨形成，还间接抑制了破骨细胞骨吸收。这种协同效应将骨重塑平衡转向合成代谢状态，从而解释了治疗小鼠骨质疏松症的快速且显著逆转。

**2.7 SA@LNP-D的体内综合生物安全性评估**
考虑到该平台的转化潜力，研究评估了SA@LNP-D治疗后的终点生物安全性。对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色显示，与PBS组相比，SA@LNP-D组未观察到明显的组织损伤、炎症浸润或结构异常。血清肝酶（ALT、AST）和肾功能标志物（UREA、CREA）水平均保持在正常生理范围内。这些结果表明，在测试的给药方案下，SA@LNP-D未引起明显的全身毒性。

**讨论与结论**
用于骨骼疾病的全身性mRNA疗法的临床转化，因传统LNP固有的肝脏积累而受到严重阻碍。这种脱靶截留不仅降低了目标部位的生物利用度，还带来了与肝脏暴露相关的潜在安全性问题。本研究通过在LNP表面修饰Asp8肽来增强其骨亲和力并减少其在肝脏的积累。结果表明，经Asp8肽表面修饰的LNP在骨质疏松症模型中表现出改善的治疗效果。这主要归因于其在骨组织中的特异性积累以及随后治疗性抗体的局部表达，实现了空间靶向——这是传统LNP无法提供的优势。组织学发现进一步证实了促成骨和抗破骨的双重效应，表明该靶向递送系统能将全身给药转化为局部疗效。

重要的是，骨靶向mRNA-LNP平台实现的局部抗体表达，可能为减少不必要的全身暴露提供一种潜在策略。临床使用的抗硬化蛋白单克隆抗体（如Romosozumab）已显示出强大的骨形成活性，但关于全身性副作用（包括心血管风险）的担忧仍是重要考量。原则上，骨富集mRNA递送和局部抗体表达可能有助于将治疗活性限制在骨骼微环境内，从而可能最小化对血管组织的脱靶效应。然而，这一潜在优势在本研究中仍是假设性的，因为未评估循环抗体水平、心血管结局以及与Romosozumab的直接比较。

本研究存在一些局限性。首先，未设置使用临床批准的Romosozumab的直接对照组。由于mRNA-LNP系统的体内表达动力学、剂量-反应关系和抗体暴露谱尚未完全确定，本研究未进行与重组抗体疗法的公平头对头比较。其次，安全性评估仅限于治疗终点时PBS与SA@LNP-D的比较。由于未将SA@LNP和Romosozumab作为安全性对照，本研究不能得出SA@LNP-D相比非靶向LNP或现有抗体疗法具有更好安全性的结论。未来研究需要明确SA@LNP-D的药代动力学、抗体表达动力学、剂量-频率关系以及急性和长期安全性特征，然后与优化的Romosozumab治疗方案进行直接比较。最后，其疗效和安全性仅在小鼠模型和治疗终点得到验证。

**结论**
总之，研究人员开发了一种骨靶向mRNA-LNP平台，该平台通过肽介导的矿物锚定策略减少了肝脏截留。通过实现治疗性抗体在骨内的定向原位表达，该方法为骨骼疾病提供了一种有前景的mRNA递送策略。然而，仍需要与临床使用的抗体疗法进行直接基准比较，以确定其相对疗效和安全性。