突触素蛋白密度会低估人脑突触计数——关于 synaptoporin 蛋白表达的解剖学研究

《Neurobiology of Disease》：Synaptophysin density underestimates synapse counts in the human brain – An anatomical study on synaptoporin protein expression

　　

Synaptoporin（SPO；突触素II，synaptophysin II）传统上被描述为一种富集于海马苔藓纤维通路的突触前囊泡蛋白（presynaptic vesicle protein），与广泛表达的突触素I（SYP）不同。然而，其在人脑中的分布及其突触类型特异性迄今尚未得到研究。本研究通过对尸检后组织进行免疫荧光染色以及对脑组织裂解液进行生物化学分析，系统绘制了 SPO 蛋白在人类多个脑区中的表达图谱。研究人员鉴定出：SPO 蛋白在海马、大脑皮层和脊髓背角中呈高表达；在小脑和杏仁核中呈中等表达；在壳核中水平较低。所分析的脑干区域和丘脑中未见 SPO 表达。值得注意的是，SPO 存在于人类听觉通路的特定组成部分中，与啮齿类动物中的表达模式相呼应。共定位分析显示，SPO 与 SYP 在很大程度上呈分离分布，这对将 SYP 视为“泛突触”（pan-synaptic）标志物的概念提出了挑战。在 SPO 表达显著的大脑皮层中，基于 SYP 的突触定量会将突触总数低估最多 35%，且这一结果在独立来源的脑组织中得到重复验证。SPO 阳性斑点（puncta）同时与兴奋性和抑制性突触标志物相关，反映出高度异质的人类突触组（synaptome）。总体而言，这些发现表明，仅依赖 SYP 的检测方法会遗漏相当一部分突触，并凸显了人脑中囊泡蛋白表达的组合复杂性。本研究确立了 SPO 是决定突触多样性的关键因素，并可作为识别神经退行性疾病中易损突触亚型的参考依据。

本文发表于《Neurobiology of Disease》，聚焦一个长期被默认却缺乏充分验证的问题：突触素I（SYP）是否能够作为人脑中可靠的“泛突触”标志物，用于评估突触密度与突触丢失。神经退行性疾病常伴随显著的突触丢失，尤其累及海马和大脑皮层，因此在尸检后人脑组织中准确识别并量化突触，是解析疾病机制和寻找临床影像标志物的重要基础。既往研究中，SYP 因表达广泛且在较长尸检间隔后仍相对稳定，常被用于免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）的突触计数。然而，随着“突触组”（synaptome）概念的发展，越来越多证据表明，人脑中存在高度异质的突触亚群，单一突触前蛋白可能无法覆盖所有突触类型。与 SYP 同属突触素家族的 synaptoporin（SPO）以往主要被视为海马苔藓纤维相关蛋白，在人脑中的分布范围、与 SYP 的关系及其对突触定量的影响尚不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在系统描绘 SPO 在人脑多脑区中的蛋白表达，并检验仅用 SYP 计数是否会系统性低估人脑突触数量。

研究人员结合蛋白质印迹（Western blot）、尸检后人脑组织免疫荧光（IF）三维成像、3D 图像重建与共定位分析，对多个中枢神经系统区域的 SPO 表达进行系统分析，并纳入不同来源的人脑皮层组织进行重复验证。样本包括商业化脑区裂解液、解剖学课程遗体捐献者脑组织、石蜡包埋正常皮层切片、即时固定冷冻保存的人颞极组织以及神经外科手术获得的皮层入路组织。研究采用 Imaris 三维表面识别统计阳性 puncta 的密度与总强度，并通过突触前-突触前及突触前-突触后共定位分析，判断 SPO 与 SYP 以及兴奋性、抑制性突触标志物的对应关系。

在结果方面，论文首先以“Enrichment of synaptoporin in human hippocampus lysates”为题，说明研究人员通过脑组织裂解液蛋白检测获得整体分布概况。结果显示，SPO 在海马（HC）中最为富集，同时在大脑皮层（CTX）和杏仁核（AMY）中也有可观表达；在间脑整体和小脑（CB）中信号较弱；在丘脑（THA）及脑干区域未检测到 SPO。相比之下，SYP 在杏仁核、海马和皮层中的水平相近，并在全部分析脑区中均可检测到，支持其广泛分布特征。该部分结果奠定了全文的核心比较框架，即 SPO 的区域选择性表达与 SYP 的广泛表达之间存在明显差异。

在“Synaptoporin expression in central human brain regions”部分，研究人员使用尸检后脑切片免疫荧光，对前述发现进行空间定位与定量确认。结果表明，SPO 阳性 puncta 在海马 CA3 区和颈段脊髓背角 lamina I 中明显富集，在大脑皮层 V 层也呈高密度分布；杏仁核与小脑中约为皮层的一半，壳核（PUT）则仅为皮层的约 20%。丘脑、脑桥、下橄榄核以及脊髓腹角 lamina IX 中几乎不见 SPO。进一步分析 puncta 总强度后发现，海马中的 SPO 相对表达量约为皮层的 3 倍，提示海马不仅阳性结构多，而且单个或局部突触相关信号更强。该部分结果说明，SPO 并非局限于海马苔藓纤维，而是分布于多个皮层与皮层下脑区，但呈显著区域选择性。

在“Synaptoporin expression in areas within the auditory system”部分，研究人员进一步扩展至听觉系统，以验证人类与啮齿动物之间的表达保守性。结果显示，SPO 在内侧膝状体（MGB）内侧分部中最强，在下丘（IC）外侧皮层和上橄榄复合体（SOC）周围区域中为中低表达，而在耳蜗核复合体（CNC）中几乎缺如。与之相对，SYP 在所有分析的听觉通路站点中均显示强表达。该结果表明，SPO 在听觉系统中的分布具有选择性，且主要见于与经典听觉主通路相关的某些伴随性区域，支持其表达模式在物种间具有较高保守性。

在“Absence of synaptophysin at the majority of synaptoporin-positive synapses”部分，文章提出全文最关键的发现之一，即 SPO 阳性突触前终末多数并不共表达 SYP。在大脑皮层、壳核和杏仁核中，平均仅约 4% 的 SPO 阳性 puncta 与 SYP 共定位；在海马中约四分之一共定位；在小脑中超过一半共定位；在脊髓背角中共定位比例最高，约为 75%。在听觉系统中，下丘约 57% 的 SPO 阳性 puncta 不含 SYP，而内侧膝状体中则以共定位为主。研究还进一步观察了黑质（SN）背侧区域，发现串珠样高强度 SPO 信号，其密度甚至高于海马，并且约 47% 的 SPO puncta 为 SYP 阳性。整体而言，这部分结果直接否定了“SYP 必然覆盖 SPO 阳性突触”的假设，提示 SYP 不是严格意义上的泛突触标志物。

在“Underestimation of synapse numbers in the human cerebral cortex with synaptophysin”部分，研究人员针对疾病研究高度关注的大脑皮层进行了独立验证。使用不同固定与来源的皮层样本后，结果一致显示：大量 SPO⁺/SYP^- 突触前结构稳定存在。若将 SPO⁺/SYP^- puncta 与全部 SYP 阳性 puncta 合并视为总突触数，则单用 SYP 染色平均仅能标记 81%—86% 的突触，而在额外样本中平均漏检约 27%，最高可达 35%。这一结果具有重要方法学意义，即当前大量基于 SYP 的人脑突触密度研究，尤其是皮层研究，可能存在系统性低估。

在“SPO is expressed at excitatory and inhibitory synapses in the cerebral cortex”部分，研究人员进一步界定 SPO 阳性突触的类型归属。通过与 GLUA2、collybistin、VGLUT1、VGLUT2、VGAT 和 MAP2 的共染，结果表明 SPO 同时存在于兴奋性与抑制性突触。部分 SPO puncta 与 GLUA2 阳性兴奋性突触相关，另一部分与 collybistin 阳性抑制性突触相关；与 VGAT 的重叠清晰，而与 VGLUT2 的重叠很少。大多数 SPO puncta 位于树突 1 μm 范围内，并沿锥体神经元顶树突及胞体周围排列。该结果说明，SPO 并非某一单一功能性突触类别的专属标志，而是参与构成皮层内复杂、多样的突触谱系。

讨论部分综合指出，SPO 在人脑中的表达显著超出既往“海马苔藓纤维富集蛋白”的传统认识，不仅存在于海马，也分布于新皮层、杏仁核、小脑、壳核、脊髓背角及特定听觉通路区域。更重要的是，SPO 与 SYP 在多数区域中并非简单共表达，而是代表部分不同的突触群体。研究人员据此强调，真正在所有突触中普遍表达的单一“泛突触”囊泡蛋白很可能并不存在，这一结论与近年来关于人类突触组高度异质性的认识相一致。文章还指出，SPO 在皮层中同时关联兴奋性与抑制性突触，提示其所定义的是一个跨经典功能分类的复杂突触集合。对神经退行性疾病研究而言，这意味着若仅依赖 SYP 或类似单一标志物，可能无法全面识别疾病易损突触亚型，也会影响新型正电子发射断层显像（PET）示踪靶点的选择和解释。

研究结论部分可概括翻译如下：本研究提供了人脑中突触前囊泡蛋白 synaptoporin 的详细表达数据。SPO 过去在很大程度上被忽视，但在 SPO 高表达的大脑皮层中，对 SYP 与 SPO 的共染显示存在数量可观的 SPO⁺/SYP^- 突触。这一发现对于识别疾病易损突触亚型具有重要意义，也提示需要开展此类研究以寻找适用于临床的 PET 示踪靶点。总体而言，未来应在人体研究中更深入解析突触亚型的规模与组成，以识别对疾病更为敏感的突触群体。