间充质干细胞分泌物可减轻创伤性脑损伤相关神经炎症中的疾病相关小胶质细胞活化及认知功能下降

《Neurochemistry International》：Mesenchymal Stem Cell Secretome Attenuates Disease-Associated Microglial Activation and Cognitive Decline in TBI-Associated Neuroinflammation

　　

普拉蒂帕·库马里·拉西亚|赛富丁·伊斯梅尔|萨莉·埃尔沙尔|艾哈迈德·M·阿瓦德|莫赫德·萨尔曼|王正军|赵洪锡|阿基莱什·K·巴杰派|弗朗西斯卡-方·廖|卢璐|米基·彭特科斯特|陶希德·伊什拉特|拉贾谢卡尔·甘加拉朱

田纳西大学健康科学中心眼科，美国田纳西州孟菲斯市麦迪逊大道930号769室，邮编38163。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）的治疗方案仍然有限，部分原因是损伤会引发小胶质细胞向与疾病相关的表型转变，从而导致持续的神经炎症和认知功能下降。我们研究了通过非侵入性的鼻腔给药方式给予间充质干细胞分泌物，能否通过调节小胶质细胞的疾病相关信号通路来改善TBI后的恢复情况。成年C57BL/6小鼠被施加中度可控的皮质冲击损伤。这些小鼠通过鼻腔接受脂肪干细胞来源的浓缩条件培养基（ASC-CCM）治疗，剂量为每天约20纳克蛋白质，共四次；而对照组则接受生理盐水注射。在损伤后7天和30天对它们的认知和记忆功能进行评估，结果显示TBI小鼠的学习、工作和长期记忆能力均有所下降，而接受ASC-CCM治疗的TBI小鼠表现与对照组相似。这些功能缺陷与星形胶质细胞增生（GFAP）和细胞凋亡（TUNEL）增加有关，而ASC-CCM能够减轻这两种现象。TBI还会导致损伤部位周围的星形胶质细胞中APOE蛋白以及撞击点附近活化的小胶质细胞中TYROBP蛋白的浓度随时间上升；ASC-CCM治疗显著降低了这两种蛋白的水平。对损伤后7天和30天的损伤周围组织进行的转录组分析表明，TBI后会显著上调与疾病相关的基因（APOE、TYROBP、TREM2），而鼻腔给予ASC-CCM可缓解这一现象。与这些发现一致的是，治疗后同侧CD11b⁺CD45^high细胞中的TREM2表达也明显降低。这些数据表明，TBI后小胶质细胞的疾病相关信号通路是一种可调控的神经化学途径，而鼻腔给予ASC-CCM能够降低小胶质细胞的活化程度，从而改善认知功能。这一策略有望为急性及慢性TBI提供一种非侵入性的治疗方法。

引言

美国每年约有200万例创伤性脑损伤病例，占所有与伤害相关的死亡人数的40%（Korley, Kelen等人，2016；Majdan, Plancikova等人，2017；Peterson, Xu等人，2019；CDC，2025）。平均而言，美国每天有166人死于包括TBI在内的各种伤害（Peterson, Xu等人，2019）。跌倒、枪击自杀、机动车事故和袭击是导致TBI的最常见原因。超过2%的美国人因TBI而出现长期的神经系统问题，尤其是认知功能障碍，这给经济带来了765亿美元的负担（Korley, Kelen等人，2016；Majdan, Plancikova等人，2017；CDC，2025）。TBI损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是由机械性损害导致的，如出血、脑震荡和挫伤。继发性损伤则是原发性损伤之后的延迟后遗症，表现为在数小时、数天乃至数月内逐渐出现的生物化学和生理变化。已有多项研究探讨了通过药物疗法来改善TBI后的继发性损伤状况（Verweij, Muizelaar等人，2000；Giacino, Whyte等人，2012；Li, Xiao等人，2016；Das, Tang等人，2019）。

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫监视细胞，它们会根据炎症和氧化应激等动态的微环境信号呈现出不同的表型（Wu, Wu等人，2021）。我们和其他研究者已经发现，TBI发生后，大脑和视网膜中的小胶质细胞会被激活，进而引发无法控制的炎症反应（Guley, Del Mar等人，2019；Jha, Pentecost等人，2019；Krukowski, Nolan等人，2021；Honig, Del Mar等人，2022）。此外，抑制小胶质细胞的活性能够显著改善TBI后的功能状况（Jha, Pentecost等人，2018；Vázquez-Rosa, Shin等人，2020）。例如，清除小胶质细胞可以缓解TBI带来的功能缺陷（Paladini, Feng等人，2021）。然而，小胶质细胞究竟是如何影响TBI中的神经退行性变以及相关的认知功能障碍的，目前仍不清楚。最近的计算生物学研究（Hickman, Kingery等人，2013；Izzy, Liu等人，2019；Zheng, Xing等人，2021），以及阿尔茨海默病领域的研究（Manich, Gómez-López等人，2020；Audrain, Haure-Mirande等人，2021）表明，与疾病相关的特殊类型小胶质细胞富含之前被认为具有促炎作用的M1型小胶质细胞，这类细胞具有更强的吞噬能力和炎症反应能力。这类疾病相关小胶质细胞表达一些在转录层面具有独特性的、与神经退行性变相关的受体和蛋白质，这些物质被统称为小胶质细胞敏感蛋白组（Hickman, Kingery等人，2013），而且很可能与Toll样受体2/4（TLR2/4）介导的激活机制有关。这些疾病相关小胶质细胞所表达的标志物（APOE、TYROBP、TREM2）在脑内的表达存在时间和空间上的规律性，而且很可能与损伤的发生密切相关（Audrain, Haure-Mirande等人，2021；Wu, Zheng等人，2021）。不过，疾病相关小胶质细胞的激活顺序、它们与损伤进展之间的关系，以及TBI发生后驱动其激活的信号和细胞反应机制，目前都尚未明确。

我们的实验室和其他研究者发现，间充质干细胞疗法有望通过抑制TBI和阿尔茨海默病发生后由小胶质细胞激活引发的炎症反应，从而延缓神经退行性变（Ebrahim等人，2024；Jha等人，2019；Zhang等人，2024）。目前已有多种基于干细胞的策略被用于治疗TBI，从神经干细胞移植（Kassi, Mahavadi等人，2018）到多能间充质干细胞的输注（Mouhieddine, Kobeissy等人，2014；Reis, Gospodarev等人，2017）。这些研究虽然证明了基于细胞的神经保护方法的有效性，但也凸显出了在规模化生产、免疫相容性以及向中枢神经系统精准输送细胞等方面的挑战。此外，间充质干细胞所产生的具体生物活性分子及其参与的信号通路也尚未完全明确。这一机制上的空白既影响了人们对这类疗法的进一步优化，也阻碍了其获得监管机构的批准。我们率先采用了富含可溶性生物分子和小囊泡的脂肪间充质干细胞浓缩条件培养基，来治疗多种临床前模型中的神经血管性疾病（Jha, Pentecost等人，2018；Jha, Pentecost等人，2019；Rasiah, Jha等人，2022；Rasiah, Jha等人，2025）。

目前尚不清楚间充质干细胞的分泌物是否可以直接作用于TBI后的疾病相关小胶质细胞，也不清楚是否可以通过非侵入性方式以有效剂量将这些分泌物送达目标部位。在这项研究中，我们提出了这样一个假设：通过鼻腔给药的方式给予ASC-CCM，可以让其到达受损的大脑，抑制疾病相关小胶质细胞的激活，进而减少TBI后的神经退行性变和认知功能下降。我们通过结合转录组分析、组织学分析、流式细胞术分析以及行为学分析，在急性期和慢性期不同时间点，研究了TBI发生后APOE、TYROBP和TREM2蛋白的表达规律，并观察了它们对治疗的反应。结果表明，鼻腔给予的ASC-CCM能够在损伤部位积累，减弱疾病相关小胶质细胞的标志物表达，同时恢复动物的识别能力和空间记忆功能。这些发现为一种潜在的非侵入性、无细胞疗法提供了依据，这种疗法旨在针对TBI中导致疾病相关小胶质细胞激活的胶质细胞间相互作用。

章节要点

间充质干细胞培养及分泌物制备

ASC-CCM（脂肪间充质干细胞浓缩条件培养基）的制备方法如前文所述（Jha, Rasiah等人，2022）。简而言之，首先将来自脂肪组织的干细胞（美国马里兰州沃克斯维尔的Lonza公司）以5.3 × 10³细胞/平方厘米的密度接种在含有EGM2MV培养基的T75培养瓶中，然后在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养。我们使用了第3到第5代的小鼠细胞。这些细胞先用DPBS溶液清洗两次，之后在含基础MEMα培养基的溶液中加入20纳克/毫升的TNFα（R&D Systems公司生产）和10纳克/毫升的IFNγ（同样来自R&D Systems公司）进行处理。

ASC-CCM的蛋白质组学特征显示其为富含小囊泡的分泌物，具有多种可溶性蛋白质成分

为了详细了解ASC-CCM的组成，我们利用了一组已发表的鸟枪法蛋白质组学数据（无需标记的液相色谱-质谱/质谱技术），这些数据来自与本研究中使用的ASC-CCM性质相同的预冻干ASC-CM样品（Gangaraju, Sohl等人，2017），但并非本研究实际使用的实验批次。我们首先确定了所有重复样本中都存在的共同蛋白质，然后通过生物信息学分析方法，结合ExoCarta外泌体蛋白质数据库对这些蛋白质进行了进一步分析。

讨论

TBI的特点是存在持续的神经免疫功能紊乱，这类紊乱会引发长期的认知功能障碍，但目前仍缺乏有效的疾病修饰疗法。在本研究中，我们发现，在中度损伤模型中，通过鼻腔给予脂肪来源的间充质干细胞浓缩条件培养基，能够在TBI发生后30天内保护动物的认知功能。我们还发现，TBI会导致与损伤相关的特殊类型小胶质细胞的表达出现时间和空间上的规律性变化，其中包括这些细胞的某些蛋白表达水平上升。

CRediT作者贡献说明

莫赫德·萨尔曼：负责文章的写作——审阅与编辑、方法学设计、实验实施、数据正式分析工作。艾哈迈德·M·阿瓦德：参与文章的写作——审阅与编辑、方法学设计、实验实施工作。萨莉·埃尔沙尔：负责文章的写作——审阅与编辑、方法学设计、实验实施、数据正式分析工作。拉贾谢卡尔·甘加拉朱：承担文章的写作——审阅与编辑、原始草稿撰写、项目监督、资源协调、项目管理工作，同时还负责方法学设计、实验实施、资金申请以及研究概念的构思工作。赛富丁·伊斯梅尔：参与文章的写作——审阅与编辑、方法学设计工作。

未引用参考文献

Ahmed等人，2022年；Alam等人，2020年；Arora等人，2002年；Audrain等人，2021年；Bachiller等人，2018年；Bonham等人，2019年；Bonsack等人，2020年；Brandenburg等人，2017年；Bray等人，2022年；Castranio等人，2017年；Cho等人，2016年；Cieri等人，2023年；Das等人，2019年；Das等人，2019年；Deselms等人，2016年；Elder等人，2019年；Elshaer等人，2021年；Elshaer等人，2018年；Ezquer等人，2019年；Farfán等人，2020年；Giacino等人，2012年；Gottlieb等人，2022年；Graham等人，2021年；Guley等人，

利益冲突声明

MP是Diadem Biotherapeutics Inc.的联合创始人，并持有该公司的股份，该公司正在研发经过工程改造的脂质囊泡产品，用于治疗炎症性疾病。其他作者均不存在任何财务利益冲突。

关于手稿准备过程中使用生成式AI及AI辅助技术的声明

在撰写这篇论文的过程中，作者们使用了Anthropic公司的Claude人工智能工具来协助整理补充表S1，该表格汇总了来自先前已发表文献的蛋白质组数据。所有输出内容都经过了作者们的审核，与原始数据进行了核对，之后才完成最终编辑。作者们对本文的内容负全部责任。

资金来源

作者们衷心感谢以下机构提供的资金支持：CDMRP—W81XWH-22-1-0697（由RG负责申请）；R01EY034716项目，美国国家眼科学研究所提供的资助（RG负责申请），美国国家神经疾病与中风研究所提供的资助，编号为NS120327，由FFL负责申请，美国国家神经疾病与中风研究所提供的另一项资助，编号为R56NS127924，由RG、TI和MP共同负责申请；1I01RX004283项目，美国退伍军人事务部设立的优秀奖项，由HC负责申请，还有用于支持预防失明组织研究的资金，该资金由汉密尔顿眼科研究所提供。

利益冲突声明

MP是Diadem Biotherapeutics Inc.的联合创始人，并持有该公司的股份，该公司正在研发经过工程改造的脂质囊泡产品，用于治疗炎症性疾病。其他作者均不存在任何财务利益冲突。

致谢

PKR感谢UTHSC提供的神经科学博士后/研究助理奖学金资助。MS则感谢美国心脏协会提供的博士后研究奖学金支持，奖学金编号为1029163。