细胞外囊泡流式细胞术中的稀释悖论

《Journal of Extracellular Vesicles》：The Dilution Paradox in Extracellular Vesicle Flow Cytometry

　　

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的浓度可通过流式细胞术（Flow Cytometry, FC）进行测定，该技术检测单个颗粒的荧光和光散射信号。为确保单项检测，血浆样本需根据其颗粒浓度进行稀释，而样本间的颗粒浓度可相差100倍。本研究探讨了样本稀释如何影响流式细胞术对EVs的检测。研究人员在人血浆中（i）加入不同浓度的纯化脂蛋白、（ii）采用不同稀释度、以及（iii）使用散射触发（Scatter-triggering）或荧光触发（Fluorescence-triggering）进行EVs测量。此外，研究人员利用分析模型评估了两项已发表临床EV研究的可靠性。结果显示，防止光散射检测器发生群检测（Swarm Detection）的最小稀释因子可能超过确保标记EVs数量超过荧光背景事件的最大稀释因子。这种"稀释悖论"使得某些样本无法可靠地同时检测EVs的荧光和光散射信号。在两项临床研究中，根据所用标记的不同，分别有30%和65%的测量结果不可靠。因此，以往研究的结果应重新评估。该稀释悖论可通过以下方式克服：采用固定样本稀释度的荧光触发、去除样本中的非EV颗粒、去除染色试剂中的荧光颗粒，以及设定更严格的纳入标准。

本研究聚焦于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）流式细胞术定量检测中一个长期被忽视的关键方法学问题——稀释悖论（Dilution Paradox）。EVs是细胞释放的纳米级膜性囊泡，在疾病诊断和预后评估中具有重要应用前景。流式细胞术作为单颗粒检测技术，可通过检测颗粒穿越激光束时产生的荧光和光散射信号来实现EVs的定量分析。然而，由于生物体液中总颗粒浓度在不同供体间可相差超过100个数量级，为确保单项检测、避免群检测现象，研究者通常采用样本特异性稀释策略，即根据各样本的总颗粒浓度调整稀释倍数。但本研究揭示，这一看似合理的操作却隐含重大方法学缺陷：高总颗粒浓度样本需要更大的稀释因子以防止散射检测器的群检测，但过度稀释又会导致标记EVs数量降至荧光背景事件水平以下，从而无法区分真实信号与背景噪声。这种"高稀释需求"与"低稀释需求"之间的内在矛盾构成了本研究命名的"稀释悖论"。该问题的发现在EVs临床转化研究中具有紧迫性，因为既往基于样本特异性稀释的临床数据可能存在系统性偏差，亟需重新审视和方法学改进。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：基于Apogee A60-Micro流式细胞仪的散射触发和荧光触发检测技术；脂蛋白掺入实验系统（采用极低密度脂蛋白VLDL和乳糜微粒混合物调控总颗粒浓度）；数学建模分析（建立描述荧光事件数与稀释因子关系的方程，定义检测限Limit of Detection, LoD和最大可靠稀释因子Dmax等参数）；以及对两项独立临床研究（AFFECT EV和CINTICS）的回顾性可靠性评估。样本队列来源于：20名健康供体的混合血浆（用于实验验证）；AFFECT EV研究（急性心肌梗死患者抗血小板治疗效果的随机对照试验，样本来自波兰华沙医科大学）；CINTICS研究（急性缺血性卒中与非缺血性卒中疑似患者的比较观察性试验，样本来自荷兰阿姆斯特丹大学医学中心）。

研究结果部分包含以下发现：

稀释悖论的发现与表征：通过脂蛋白掺入实验（Series 1），研究人员证明当总颗粒浓度从7.3×10¹⁰ mL^-1增至1.0×10¹⁴ mL^-1时，为防群检测所需稀释因子增大，但CD45⁺事件的检测量并非随稀释线性降至零，而是在约52个计数处出现平台，表明荧光背景事件的存在；CD62p⁺事件甚至完全呈现背景特征。计算浓度显示，稀释因子>10³时，CD45⁺ EVs浓度被显著高估，证实样本特异性稀释导致不同稀释度样本间的浓度不可比。

解决方案一：系列稀释法：对同一样本进行系列稀释（Series 2），通过拟合方程获取背景事件数（N_b）和未稀释样本中的荧光事件数（N₀），可计算得出与稀释无关的真实浓度。CD45⁺和CD62p⁺事件浓度分别为2.12×10⁷±1.98×10⁶ mL^-1和2.04×10⁶±3.22×10⁵ mL^-1。

解决方案二：荧光触发联合固定稀释：在总颗粒浓度变化的脂蛋白掺入样本中，采用固定500倍稀释和荧光触发（Series 3），CD45⁺事件计数保持稳定（283±32，变异系数11.0%），浓度为2.39×10⁷±2.64×10⁶ mL^-1，与系列稀释法结果一致，且不受群检测影响。

两项临床研究的回顾性可靠性评估：AFFECT EV研究中，不同标记的可靠数据比例差异显著：CD146p-PE为0%，CD45-APC约30%，CD31-APC达99%；CINTICS研究中，CD31为93%，而CD326为0%。总体而言，两项研究均无任一标记达到100%可靠，其中AFFECT EV和CINTICS研究中不可靠数据比例最高分别达65%和70%（依标记而异）。

讨论部分，研究人员系统阐述了稀释悖论的成因、影响及应对策略。荧光背景事件的来源可能包括：抗体等标记试剂的聚集体、标记试剂与非EV颗粒（如脂蛋白）的非特异性结合、以及流体噪声和仪器噪声。尽管背景事件的确切来源超出本研究范围，但其对浓度测量的影响已明确。研究人员强调，样本特异性稀释策略应被摒弃，而代之以固定稀释因子策略，其中荧光触发配合固定稀释为推荐方案。散射触发理论上适用于总颗粒浓度变异较小的场景，但临床前通常无法预知这种变异，故荧光触发更为稳妥。然而，荧光触发下散射检测器的群检测问题会限制基于散射的尺寸校准信息的获取，而尺寸信息对区分EVs与血小板等杂质至关重要。为此，研究人员探讨了荧光标记脂质体标准品进行荧光法尺寸校准的替代方案，但同时指出该方法假设脂质体与EVs具有可比的荧光标记密度，这一假设在群体水平上或许成立，仍需进一步验证。

研究结论部分指出：荧光背景事件与样本特异性稀释相结合，通过"稀释悖论"导致EV浓度测量出现高估和样本间不可比。采用样本特异性稀释的研究成果应被重新评估。为获得可比较且可重复的浓度测量，可采用散射触发下的系列稀释法（不推荐），或采用荧光触发下的固定稀释法（推荐），尽管后者在部分高总颗粒浓度样本中存在散射检测器群检测的风险。本研究提出的方法学建议将有助于提升EV流式细胞术的可重复性和可比性，最终加速其临床转化应用。