扁桃体源性间充质干细胞分化的雪旺细胞样细胞通过诱导巨噬细胞极化促进慢性坐骨神经压迫损伤模型中的周围神经再生

《Muscle & Nerve》：Administration of Schwann Cell-Like Cells Differentiated From Tonsil-Derived Mesenchymal Stem Cells Promotes Peripheral Nerve Regeneration by Inducing Macrophage Polarization in a Chronic Constriction Injury Model

　　

引言/目的：从人扁桃体源性间充质干细胞（TMSCs）分化而来的雪旺细胞样细胞（TMSC-SCs）分泌许多与神经再生相关的因子。本研究旨在利用周围神经慢性压迫损伤（CCI）动物模型，探索TMSC-SCs作为周围神经再生治疗剂的潜力。

方法：在本研究中，将TMSCs或TMSC-SCs与纤维蛋白胶混合后，施用于CCI大鼠的坐骨神经，并观察2-8周（实验1）。此外，还将纤维蛋白胶与低剂量或高剂量TMSC-SCs（TMSC-SC-L或TMSC-SC-H）的混合物施用于相同部位，并观察2-4周（实验2）。给药后，通过神经传导研究（NCS）和组织病理学观察，确认周围神经和腓肠肌的再生以及运动功能的恢复。在TMSC-SC处理后检测了M1和M2巨噬细胞标志物的表达。

结果：基于神经传导研究、髓鞘形成评估和腓肠肌观察，TMSC-SC-H处理组与TMSC或TMSC-SC-L处理组相比，显示出显著的再生效果。此外，通过蛋白质印迹法（WB）观察到，与TMSC-SC-L组（M1: 1.02 ± 0.15, M2: 0.73 ± 0.06）相比，TMSC-SC-H组（M1: 0.47 ± 0.03, M2: 1.04 ± 0.11）中M1巨噬细胞标志物下调，M2巨噬细胞标志物上调。

讨论：这些结果表明，TMSC-SCs可以开发为一种同种异体治疗剂，以改善周围神经损伤患者的周围神经再生。这些发现可以作为解决周围神经再生未满足临床需求的一种测试方法。

**论文解读：扁桃体源性间充质干细胞分化的雪旺细胞样细胞通过诱导巨噬细胞极化促进慢性坐骨神经压迫损伤模型中的周围神经再生**

**研究背景与意义**

周围神经损伤（Peripheral Nerve Injury, PNI）是临床常见问题，可导致严重的运动和感觉功能障碍。慢性压迫损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）属于Seddon周围神经损伤分类中的第二类，其特征是轴突及其髓鞘的破坏性病变，导致损伤区域的感觉和运动缺陷、神经传导异常以及骨骼肌异常。目前，CCI的非手术治疗方法包括电或磁刺激、低强度超声、光疗和光生物调节疗法，以及使用神经生长因子。细胞疗法，如移植雪旺细胞（Schwann Cells, SCs）、间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）等，也被研究用于治疗。其中，MSCs因其迁移至损伤部位和分泌生物活性因子的能力，在组织再生中扮演重要角色，并能分化为髓鞘形成细胞和雪旺细胞样细胞（Schwann Cell-Like Cells）。特别是，扁桃体源性间充质干细胞（Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells, TMSCs）在MSCs中具有高产量和高增殖率，并具有分化为雪旺细胞样细胞（TMSC-SCs）的潜力。先前研究已证实TMSC-SCs在部分坐骨神经结扎（pSNL）或神经缝合（PNI-neurorrhaphy）的动物模型中具有治疗效果。然而，在CCI模型中，长期压迫可能导致严重的神经变性、纤维化和肌肉萎缩。因此，研究人员在特定实验（如神经修复和再生研究）中移除结扎缝线，以最小化长期神经损伤并研究神经再生机制。本研究旨在探索TMSC-SCs作为同种异体治疗剂，促进周围神经损伤患者神经再生的潜力，相关成果发表在《Muscle 》期刊上。

**关键技术方法**

本研究采用了一系列关键技术方法。首先，研究人员从人扁桃体组织中分离并培养了TMSCs，并在层粘连蛋白包被的培养皿中，使用含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）、毛喉素和重组人heregulin-β1的培养基，将其诱导分化为TMSC-SCs。细胞冻存于含有冷冻保护剂的溶液中，直至治疗使用。动物实验使用7周龄、体重150-200克的雄性Sprague-Dawley大鼠建立CCI模型：在坐骨神经上以1毫米间隔结扎四道缝线，一周后移除缝线以模拟慢性压迫后解除压迫的状态。将TMSCs或不同剂量（低剂量5 × 10⁵，高剂量5 × 10⁶）的TMSC-SCs与纤维蛋白胶（Fibrin Glue, FG）混合后，移植到CCI大鼠的坐骨神经损伤部位。实验设计分为两部分：实验一比较了未分化的TMSCs与分化的TMSC-SCs在给药后2、4、8周的效果；实验二则评估了低剂量（TMSC-SC-L）和高剂量（TMSC-SC-H）TMSC-SCs在给药后2、4周的效果，并在2周时检测了巨噬细胞标志物。评估手段包括在给药后特定时间点进行神经传导研究（NCS）以测量复合肌肉动作电位（CMAP）和神经传导速度（NCV）；对坐骨神经进行免疫组织化学（IHC）染色检测髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经丝重链（NF-H）以评估髓鞘再生；对腓肠肌进行苏木精-伊红（H&E）染色以观察肌肉形态；利用透射电子显微镜（TEM）观察轴突超微结构并计算G比值以量化髓鞘厚度；通过蛋白质印迹法（WB）和IHC检测M1（CD86）和M2（CD206）巨噬细胞标志物的表达。所有数据均进行统计学分析。

**研究结果**

**3.1 TMSCs和TMSC-SCs给药后神经传导的恢复（实验1）**
神经传导研究显示，在给药后2周，CCI组和FG组的CMAP和NCV反应微弱。给药后4周，FG+TMSC组和FG+TMSC-SC组的CMAP相较于CCI组显著增加，且FG+TMSC-SC组的CMAP显著高于CCI组和FG组。在2周和4周时，FG+TMSC组和FG+TMSC-SC组的NCV均高于CCI组和FG组，其中FG+TMSC-SC组在4周时相较于CCI组增加尤为显著。

**3.2 TMSCs和TMSC-SCs给药后坐骨神经和腓肠肌的恢复（实验1）**
免疫组织化学染色显示，野生型（W）组神经被圆环状的髓鞘（MBP）包围。CCI大鼠则表现为无髓鞘神经或没有神经的空环状髓鞘。给药后4周，FG+TMSC组的有髓轴突百分比显著高于CCI组，而FG+TMSC-SC组则显著高于其他所有组，其髓鞘形成速度与W组相似。给药后8周，CCI组的有髓轴突比例虽较4周时有所增加，但仍显著低于其他实验组。H&E染色显示，给药后4周，仅CCI组未能形成正常的肌肉纤维形态，FG组出现圆形肌纤维而非正常的六边形。给药后8周，除CCI组和FG组外，其他组的肌纤维尺寸均增大，且仅CCI组和FG组仍观察到圆形肌纤维。

**3.3 不同剂量TMSC-SCs给药后神经传导的恢复（实验2）**
给药后2周，各组CMAP无显著差异。给药后4周，FG+TMSC-SC-L组的CMAP相较于CCI组和FG组有所增加，而FG+TMSC-SC-H组的CMAP则显著高于CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组。NCV结果显示，给药后2周，各移植组与对照组无显著差异；给药后4周，FG+TMSC-SC-H组的NCV显著增加，约为CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组的两倍。

**3.4 不同剂量TMSC-SCs给药后坐骨神经和腓肠肌的恢复（实验2）**
免疫组织化学显示，给药后2周和4周，移植组的环状有髓神经数量增加。给药后2周，FG+TMSC-SC-H组的有髓轴突百分比显著高于CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组。给药后4周，FG组、FG+TMSC-SC-L组和FG+TMSC-SC-H组的有髓轴突百分比均显著高于CCI组，其中FG+TMSC-SC-H组显著高于所有实验组，且达到与W组相似的水平。H&E染色显示，在2周和4周时，CCI组均未观察到成形的肌纤维，FG组出现圆形肌纤维。给药后4周，肌纤维尺寸按W组、TMSC-SC-H组、TMSC-SC-L组、FG组的顺序递减。

**3.5 不同剂量TMSC-SCs给药后2周和4周坐骨神经结构的恢复（实验2）**
透射电镜观察显示，给药后2周，CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组的脱髓鞘神经纤维直径和髓鞘厚度相较于W组显著减少，而FG+TMSC-SC-H组则相较于其他实验组增加。给药后4周，所有实验组的轴突形态和厚度均较2周时改善，其中FG+TMSC-SC-H组的髓鞘神经纤维形态与W组最为相似。G比值分析表明，给药后2周，FG+TMSC-SC-H组的G比值显著低于所有其他组。给药后4周，FG+TMSC-SC-L组和-H组的G比值均显著低于CCI组和FG组，并呈现剂量依赖性降低趋势。

**3.6 神经损伤后M1和M2巨噬细胞对神经再生的影响（实验2）**
免疫组织化学和蛋白质印迹分析显示，给药后2周，CCI组主要表达M1标志物（CD86），W组主要表达M2标志物（CD206）。FG组同时表达两种标志物。在TMSC-SC-L和-H组中，主要表达M2标志物，同时弱表达M1标志物，且TMSC-SC-H组的M2标志物表达水平和形态更接近W组。定量分析显示，TMSC-SC-H组的CD206相对于CD86的表达值显著高于CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组，呈现剂量依赖性趋势。蛋白质印迹结果进一步证实，FG+TMSC-SC-H组的CD86表达显著低于CCI组、FG组和FG+TMSC-SC-L组，而CD206表达则显著高于这些组。

**讨论与结论**

**讨论部分总结：**
本研究证明，在CCI动物模型中，施用TMSC-SCs可通过诱导巨噬细胞极化来促进周围神经再生。TMSC-SCs与纤维蛋白胶联合应用能有效诱导周围神经及相关肌肉的再生，并促使巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变。
针对PNI的细胞疗法可加速轴突再生并恢复肌肉功能。本研究所用的TMSC-SCs是同种异体冻存细胞，解冻后可与FG立即使用，有望在临床应用中于损伤当日即可使用。临床研究报道，自体SC移植治疗PNI在超过1年的长期随访中未出现恶性肿瘤等不良反应，且同种异体TMSC-SCs在各种周围神经疾病动物模型中也显示出治疗效果且无不良反应。
先前研究表明，TMSC-SCs比TMSCs表达更高水平的肝细胞生长因子（HGF）、神经调节蛋白1、神经生长因子（NGF）和神经营养因子-3等神经营养因子，这些因子在神经再生过程中产生有益的协同效应。TMSC-SCs的这种潜力被认为是本研究中细胞给药后大鼠运动功能和神经再生得以改善的原因。
巨噬细胞在周围神经损伤后作为重要的抗原呈递细胞，可刺激促进炎症和修复损伤的免疫反应，并激活SCs的增殖与分裂。这些细胞在损伤后获得更强的吞噬和分泌能力，有助于清除损伤部位的碎片，并增加包括NGF和脑源性神经营养因子（BDNF）在内的关键生长因子的释放，这些因子参与SCs的再生和增殖。本研究中CD86和CD206的表达模式与周围神经再生相关，其机制可能与参与巨噬细胞转化的HGF有关。先前研究显示，TMSC-SCs比TMSCs表达更高水平的HGF，并且在给药于PNI动物时，给药部位坐骨神经中的HGF表达增加。因此，本研究提出TMSC-SC-H的治疗作用机制是促使巨噬细胞从M1向M2表型转换。
CCI动物模型主要用于疼痛机制研究，但本研究基于其也可用于评估由周围神经CCI诱导的神经再生和运动功能恢复。因此，未来研究也应评估TMSC-SCs给药后的疼痛相关标志物或行为实验。此外，虽然CCI模型具有制造相对简单、可重复性高的优点，但也需要一定技巧，因为损伤程度可能因结扎力度而异。最后，需要进一步研究以确定影响FG+TMSC-SC-H给药效果的具体分泌因子或分子，并确认给药细胞在体内的分布情况。

**研究结论翻译：**
在本研究中，研究人员证明了施用TMSC-SCs可通过在CCI动物模型中诱导巨噬细胞极化来促进周围神经再生。TMSC-SCs与纤维蛋白胶混合应用可有效诱导周围神经及相关肌肉的再生，并诱导巨噬细胞从促炎性M1表型向抗炎性M2表型转变。在CCI大鼠中施用FG+TMSC-SC-H观察到了统计学上显著的治疗效果。值得注意的是，给药2周后坐骨神经组织中巨噬细胞标志物表达从M1向M2的转化，可以解释TMSC-SCs促进坐骨神经损伤恢复和神经再生的治疗机制。这些结果表明，TMSC-SCs在除挤压伤外，由结扎和横断等其他原因引起的PNI状况中也可能具有治疗潜力。未来要将TMSC-SCs应用于PNI治疗，需要在CCI、pSNL、SNL、SNI和SNT等动物模型中进一步研究，以验证其给药后对神经再生和神经肌肉接头恢复的效果。