《European Journal of Human Genetics》：Identifying genetic causes and establishing a diagnostic approach for WES-negative pediatric population with neurodevelopmental disorder
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全面性发育迟缓（Global Developmental Delay, GDD）和智力障碍（Intellectual Disability, ID）常由遗传因素导致，但许多患者即使在完成全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）后
全面性发育迟缓（Global Developmental Delay, GDD）和智力障碍（Intellectual Disability, ID）常由遗传因素导致，但许多患者即使在完成全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）后仍无法确诊。本研究旨在对WES后病因不明的GDD/ID儿科患者应用光学基因组图谱（Optical Genome Mapping, OGM）和Illumina完整长读长测序（Illumina Complete Long Reads, ICLR），并提出一个可供临床实施的实用诊断策略。研究人员对87例既往WES后病因不明的GDD/ID儿科患者进行了OGM和ICLR分析。对于检测结果不一致的病例，使用缺口聚合酶链式反应（gap-PCR）或PacBio长读长测序进行了进一步的验证。此外，还进行了小基因（minigene）实验以确认一个内含子变异的致病性。在87例患者中，发现6例携带致病性或可能致病的变异，包括4个结构变异（Structural Variants, SVs）和2个单核苷酸变异（Single Nucleotide Variants, SNVs）。OGM和ICLR分别提供了4.71%和6.98%的额外诊断率。OGM在检测复杂重排方面效果显著，而ICLR在检测重叠结构变异方面表现良好。就所有SVs的总体检出情况而言，ICLR检测到8个SVs（平均每样本0.09 ± 0.33个），OGM检测到8个SVs（平均每样本0.09 ± 0.29个），显示出可比的结果。本研究证明了ICLR和OGM在检测GDD/ID中各类致病性变异方面的互补效用。ICLR在检测非编码SNVs以及提供SVs的精确断点分辨率方面具有优势，而OGM在检测复杂重排和重复区域方面效果显著。这些发现支持一种分步诊断策略，即ICLR可考虑作为WES阴性GDD/ID病例的早期二级检测手段。
**神经发育障碍遗传诊断新技术的互补应用与策略优化：基于WES阴性儿科人群的研究解读**
**研究背景与意义**
全面性发育迟缓（GDD）和智力障碍（ID）是神经发育障碍的常见表现，遗传因素是近半数病例的病因。目前临床指南推荐染色体微阵列分析（CMA）和脆性X综合征检测作为一线检查，若结果不明则进行全外显子组测序（WES）。然而，WES的诊断率有限，仅约35%，这主要归因于其技术局限性和分析范围受限，特别是在检测结构变异（SVs）、重复扩增、非编码变异以及测序困难区域的变异方面。因此，全基因组测序和全基因组范围的SV检测方法正日益被探索作为补充手段。Illumina完整长读长全基因组测序（ICLR WGS）可在单一平台内同时进行短读长和长读长测序，并具备直接比较来自同一仪器的短读长和长读长结果的能力。相比之下，Bionano光学基因组图谱（OGM）无需测序即可分析超长DNA分子，尤其擅长识别非常大的结构变异（>50 kb）和平衡易位，这些变异即使使用长读长测序技术也可能难以检测。本研究旨在通过对一组WES后仍无法确诊的GDD/ID儿科患者应用全基因组测序和基于长读长DNA的基因组技术，鉴定其遗传病因，评估两种平台的诊断率，并为神经发育障碍提出一个扩展的遗传评估策略。本研究发表在《European Journal of Human Genetics》。
**关键技术方法**
本研究对来自首尔国立大学医院Lee罕见病项目的儿科患者队列进行了分析，排除了已知非遗传原因或CMA结果阳性的患者后，对213例病因不明的GDD/ID患者进行了三重WES。在115例WES阴性患者中，最终有87例有可用样本并进行了下游OGM和/或ICLR分析。研究采用的主要技术方法包括：1. **短读长WES**：使用NovaSeq 6000平台进行测序，数据经标准流程比对（hg19）和变异注释，并依据ACMG指南进行致病性评估。2. **Illumina完整长读长全基因组测序（ICLR）**：遵循Illumina的完整长读长制备方案，通过标记和未标记文库的短读长测序，利用DRAGEN平台重建高精度长读长，并整合短读长数据进行变异检测。3. **光学基因组图谱（OGM）**：使用Bionano平台分离超高分子量DNA，通过DLE-1酶进行标记和成像，利用Bionano Solve软件进行CNV分析和从头组装以检测SVs。4. **变异验证方法**：对于ICLR与OGM结果不一致的病例，使用缺口PCR或PacBio长读长测序进行验证；对于可能影响剪接的深内含子变异，使用基于pSPL3载体的**小基因实验**进行功能验证。
**研究结果**
**综合诊断结果**
在87例WES阴性患者中，ICLR和OGM共鉴定出6例携带致病性或可能致病性变异（4例SVs，2例SNVs）。OGM在85例检测病例中诊断出4例（4.71%），ICLR在86例检测病例中诊断出6例（6.98%），表明ICLR的额外诊断率略高于OGM。所有六个诊断性变异均由ICLR识别，而OGM仅识别了其中四个。
**病例描述**
1. **病例1 (GL00109P)**：一名患有GDD和肌张力减退的2岁女童，携带涉及SMARCC2外显子12-15的3.3 kb杂合缺失，被ICLR和OGM共同检出，该基因与常染色体显性Coffin-Siris综合征8型相关，变异被归类为可能致病。
2. **病例2 (GL00355P)**：一名患有GDD、肌张力减退、小头畸形等特征的1岁男童，携带涉及ATRX外显子2-9的73 kb半合子缺失，被ICLR和OGM共同检出，该基因与X连锁智力障碍-肌张力减退面容综合征相关，变异被归类为致病性。
3. **病例3 (GL00609P)**：一名患有GDD和癫痫先兆的4岁男童，携带涉及ZEB2的1.6 Mb杂合缺失，被ICLR和OGM共同检出。OGM额外揭示了涉及染色体4和2的复杂重排（倒位插入导致的不平衡易位），而ICLR仅检测到染色体内事件，凸显了OGM在解析复杂染色体重排方面的优势。
4. **病例4 (GL00676P)**：一名患有GDD、ID、癫痫、自闭症等多种症状的9岁男童，携带涉及KANSL1外显子3的5.6 kb杂合缺失。该变异由ICLR检测到，在OGM基因组图谱中也存在，但因位于DLE-1 SV过滤器的屏蔽区域而被默认OGM SV调用集排除，经手动检查确认。该基因与常染色体显性Koolen-De Vries综合征相关，变异被归类为可能致病。
5. **病例5 (GL00206P)**：一名患有ID、身材矮小、肾发育不良等症状的12岁男童，携带MT-TL1基因的异质性m.3243 A>G变异，仅由ICLR检出，该变异已知可导致MELAS（线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作）。
6. **病例6 (GL00372P)**：一名患有GDD、灰质异位、小头畸形等症状的1岁男童，携带RNU4-2基因的杂合插入变异，仅由ICLR检出，该变异是已知的复发性致病突变，可破坏剪接体功能并导致常染色体显性ReNU综合征。
**KCNJ6内含子变异的功能验证**
在病例GL00277P中，ICLR检测到KCNJ6基因的一个深内含子SNV，其SpliceAI评分较高（0.56）。小基因实验显示，除了263 bp的野生型转录本外，还存在一个574 bp的异常转录本，其中在外显子3和4之间插入了311 bp的**假外显子**。异常异构体的优势表达表明剪接受到破坏，但两种转录本共存提示不完全的剪接缺陷。由于KCNJ6缺乏已知的单倍剂量不足或功能丧失致病机制证据，该变异目前被归类为具有功能证据支持剪接改变的**意义未明变异**。
**OGM与长读长测序的不一致发现**
在三个病例中，SVs仅被一个平台检测到，导致OGM与ICLR结果不一致。通过缺口PCR或PacBio测序进行正交验证后发现：一个OGM检出的CTCF缺失被证实为假阳性；一个OGM检出的NAA15插入被证实为常见人群变异，归类为可能良性；一个仅由ICLR检出的KMT2C缺失（位于一个倒位重复内）被PacBio测序验证，而OGM仅检测到高频率的倒位信号。
**SV检测计数与方法学比较**
研究人员比较了OGM和ICLR的SV检测负荷。经过序贯过滤（包括大小>1 kb、与OMIM基因编码区重叠、排除复发性SVs等标准），两个平台最终均保留了8个具有潜在临床相关性的候选SVs（平均每样本0.09个）。在这8个变异中，仅有3个被验证为真正的致病性SVs，其余5个为平台特异性假阳性。
**讨论与结论**
**讨论总结**
本研究评估显示，在病因不明的GDD/ID病例中，ICLR显示出比OGM更高的额外诊断率（6.98% vs. 4.71%）。值得注意的是，仅就SV诊断而言，ICLR显示出相似的诊断率（4.65%），表明其优势不仅在于SNV检测，也在于识别SVs。然而，ICLR的额外诊断率未达到先前基因组测序或长读长测序研究报告的上限范围，这可能归因于本研究严格的过滤策略以及ICLR依赖于短读长重建。所有由ICLR识别的SVs在短读长BAM文件中均显示出相应的**分裂读取**信号，这表明ICLR在合成**长读长重建**过程中利用了短读长衍生的信息，这可能部分限制了其解析复杂SVs的能力。同样，OGM的额外诊断率也低于先前在WES阴性神经发育病例中的报告。
ICLR识别出的KCNJ6深内含子SNV，经小基因实验证实了假外显子化，支持了剪接破坏。然而，由于该基因缺乏已确立的单倍剂量不足致病机制，其临床解释仍不确定。该案例凸显了结合长读长测序与功能实验以解释内含子变异的价值。
研究观察到多个SVs仅被一个平台检测到的情况，需要进行正交验证。例如，在NAA15插入案例中，ICLR的漏检反映了其在Alu富集区域的比对挑战；而在KMT2C缺失案例中，PacBio测序验证了倒位重复内的缺失结构，显示了其在解析复杂、重叠SVs方面的优势，而OGM则因标签密度稀疏、大信号主导以及分裂分子比对分辨率有限而可能漏检此类变异。
总而言之，ICLR能够实现碱基对水平的断点精修，并改善了通常被外显子组测序或短读长基因组测序漏检的深内含子和非编码变异的检测。而OGM通过其超高分子量DNA的光学图谱，擅长检测大型和复杂的重排，包括多断点倒位以及染色体间和染色体内的易位，这使得其能够可视化测序方法难以解析的SVs，尽管OGM无法捕获小规模的序列水平变化。PacBio HiFi GS为SVs、重复扩增和单倍型分型提供了最全面的长读长解决方案，但需要高分子量DNA且单样本成本较高，可能限制其更广泛的临床实施。
本研究强调了OGM和ICLR在评估病因不明的GDD/ID方面的临床效用。虽然结合两种平台能提供最全面的变异检测，但在临床环境中，分步方法可能更实用。鉴于其更高的诊断率以及同时检测SNVs和SVs的能力，ICLR可作为一线检测，而OGM可作为后续检测，以发现测序方法漏检的大型或复杂重排。然而，与真正的单分子长读长平台（如PacBio）相比，ICLR存在局限性，因为它依赖于短读长的测序和扩增。
**研究结论**
本研究证明了OGM和ICLR在识别病因不明的GDD/ID患者中致病性变异方面的互补优势。ICLR显示出略高的诊断率，这归功于其检测内含子或小型结构变异的能力，并显示出更优的断点分辨率。相比之下，OGM在解析复杂、大规模和平衡的重排方面表现出色，加强了其在评估整体基因组结构方面的效用。虽然每个平台都有特定的局限性，但它们的结合使用提高了诊断的敏感性和广度，支持在遗传诊断中采用多模式策略。研究结果表明，结合OGM和ICLR为传统的基于WES的诊断提供了一种实用且全面的替代方案。将这两种技术整合到临床工作流程中，可以提高诊断准确性，并拓宽神经发育障碍病例中可检测的变异类型范围。
