利用新型程序性死亡配体1特异性TCR工程化改造T细胞以靶向免疫细胞和癌细胞

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Engineering T cells with a novel PD-L1-specific TCR targeting immune and cancer cells

　　

癌症免疫系统中，识别和清除癌细胞发挥着核心作用，然而许多肿瘤通过创建由抑制性细胞因子、检查点分子和耐受性免疫细胞亚群驱动的免疫抑制性微环境来逃避免疫监视。逆转这种抑制已在治疗上得到追求，最显著的是通过阻断程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）轴等免疫检查点。作为这些方法的补充，研究人员此前已鉴定出天然存在的促炎性T细胞，其可识别肿瘤微环境（TME）中由关键免疫抑制性细胞表达的抗原。其中，PD-L1特异性T细胞在健康供者和癌症患者中均有检出，且能够清除表达PD-L1的肿瘤细胞和免疫细胞，凸显了其免疫调节潜力。重要的是，其治疗相关性在一项临床试验中得到证实：PD-L1和吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）衍生肽疫苗联合PD-1阻断在转移性黑色素瘤患者中实现了高缓解率。虽然这些基于疫苗的策略已显示出明确的治疗前景，但其疗效可能受到T细胞活化变异性和肿瘤免疫逃逸的限制。工程化T细胞的过继转移为增强这些免疫调节性T细胞应答提供了一种补充方法。本研究中，研究人员旨在将PD-L1特异性T细胞的有前景特性转化为明确的细胞治疗。为此，研究人员从识别PD-L1衍生表位PDL101的单克隆T细胞培养物中重建了一种PD-L1特异性TCR，并利用基于非病毒CRISPR-Cas9的编辑将其引入7名健康供者原代CD8⁺ T细胞的TRAC基因座。同时，研究人员敲除内源性TRBC基因座以尽量减少TCR错配。两种使用的向导RNA均介导了内源性CD3-TCR复合物的高效敲除。用PDL101负载的人白细胞抗原A2（HLA-A2）四聚体对工程化T细胞进行染色，证实了PDL101-TCR-T细胞的产生，并使得携带转基因TCR的细胞得以富集和扩增，产生了高度特异性的T细胞培养物。在受到其同源抗原刺激后，PDL101-TCR-T细胞产生了强烈的效应应答，特征为干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生以及脱颗粒标志物CD107a的上调。更重要的是，PDL101-TCR-T细胞显示出强效的抗原依赖性细胞毒性，以浓度依赖性方式有效裂解负载肽段的TAP缺陷型T2靶细胞。此外，T细胞还消除了负载较长PD-L1衍生肽段PDL1Long1的靶细胞，这与嵌入的PDL101表位的TAP非依赖性加工和交叉呈递一致。抗原依赖性细胞毒性呈剂量依赖性，在低至皮摩尔范围内仍维持稳健的靶细胞裂解。

## 研究背景与问题提出

免疫系统在识别和清除癌细胞中发挥核心作用，但许多肿瘤通过构建免疫抑制性微环境逃避免疫监视，该微环境由抑制性细胞因子、免疫检查点分子及耐受性免疫细胞亚群共同驱动。针对程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）轴的免疫检查点阻断是当前逆转肿瘤免疫抑制的主要策略。研究人员此前已鉴定出天然存在的促炎性T细胞，可识别肿瘤微环境（TME）抗原，其中PD-L1特异性T细胞在健康供者和癌症患者中均有检出，能够清除表达PD-L1的肿瘤细胞和免疫细胞，在一项临床试验中，PD-L1和吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）衍生肽疫苗联合PD-1阻断在转移性黑色素瘤患者中实现了高缓解率。然而，疫苗策略的疗效可能受限于T细胞活化变异性及肿瘤免疫逃逸。过继转移工程化T细胞可作为补充手段增强免疫调节性T细胞应答，这促使研究人员将PD-L1特异性T细胞特性转化为细胞治疗产品。

## 主要技术方法

本研究采用的核心技术包括：基于非病毒CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物的基因编辑技术，用于将PDL101-TCR敲入TRAC基因座并敲除内源性TRBC基因座；荧光激活细胞分选（FACS）技术进行CD3⁺PDL101-四聚体⁺细胞富集；快速扩增方案（REP）进行细胞扩增；负载PDL101或PDL1Long1肽段的TAP缺陷型T2细胞用于铬-51（⁵¹Cr）释放细胞毒性实验；利用M-CSF/IL-4/IL-10/肿瘤细胞条件培养基或GM-CSF/IL-6体外诱导自体CD14⁺髓系细胞向肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样或骨髓来源抑制细胞/巨噬细胞M2型（MDSC/M2-like）表型分化；酶联免疫斑点（ELISPOT）和胞内细胞因子染色（ICS）检测T细胞应答；负载肽段并辐照的树突状细胞（DC）用于选择性扩增PDL101-TCR⁺ T细胞。

## 研究结果

### PDL101-TCR-T细胞的构建与特异性验证

研究人员从识别PDL101表位的单克隆T细胞培养物中重建PD-L1特异性TCR，通过CRISPR-Cas9介导的TRAC基因座敲入和TRBC基因座敲除，在7名健康供者中制备工程化CD8⁺ T细胞。FACS富集后获得高度特异性T细胞培养物。PDL101-TCR-T细胞受同源抗原刺激后产生强烈效应应答，表现为IFN-γ、TNF-α分泌及CD107a脱颗粒标志物上调。在⁵¹Cr释放实验中，PDL101-TCR-T细胞以浓度依赖性方式有效裂解负载PDL101的T2靶细胞，对较长PDL1Long1肽段负载靶细胞同样有效，证实TAP非依赖性加工和交叉呈递，细胞毒性在低至皮摩尔浓度仍可检测到。

### PDL101-TCR-T细胞对PD-L1表达癌细胞的靶向作用

研究人员选用源自同一患者的两种HLA-A2⁺皮肤T细胞淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC-2a作为靶细胞。结果显示，来自5名不同供者的PDL101-TCR-T细胞优先裂解MAC-1细胞，这与仅MAC-1细胞表达可检测水平表面PD-L1的观察结果一致。

### PDL101-TCR-T细胞对PD-L1表达髓系免疫细胞的靶向作用

研究人员将3名供者自体CD14⁺细胞分别诱导分化为TAM样表型（M-CSF/IL-4/IL-10/MDA-MB-231肿瘤细胞条件培养基）和MDSC/M2-like表型（GM-CSF/IL-6）。两种分化条件均上调PD-L1表达，TAM样细胞高表达CD163和CD206、低表达CD86和HLA-DR，呈现耐受性表型；GM-CSF/IL-6条件产生混合髓系群体。ELISPOT和ICS检测显示，2/3供者对TAM样细胞有显著T细胞应答，所有3名供者对MDSC/M2-like细胞产生 robust 应答，尽管TAM样细胞PD-L1表达更高，MDSC/M2-like细胞却诱导更强T细胞应答，可能与抗原呈递或共刺激能力差异相关，MDSC/M2-like细胞CD86平均荧光强度更高。

### PDL101-TCR-T细胞的耗竭状态、检查点协同及选择性扩增

与肽段负载T2细胞共培养48小时后，PDL101-TCR-T细胞抗原驱动上调PD-1、LAG-3和CD25。添加抗PD-1处理对IFN-γ分泌呈变量效应，在PD-1高表达供者中可见适度增强，提示与免疫检查点阻断的潜在协同治疗价值。

针对CRISPR-Cas9编辑后PDL101-TCR整合和表达率低于病毒转导的问题，研究人员探索肽段负载DC体外选择性扩增策略。初始编辑产生9-12% PDL101-TCR⁺ T细胞，经两轮自体肽段负载DC刺激后扩增5-6倍至50-65%。富集后的PDL101-TCR-T细胞还能以PD-L1依赖性方式识别自体未负载肽段DC，这可能实现对PD-L1⁺耐受性DC的优先靶向，但也存在耗竭抗原呈递细胞的风险。

## 讨论与安全性考量

从转化角度，靶向PD-L1表达细胞的安全性是重要考量。现有PD-L1靶向CAR-T细胞研究已提出脱靶肿瘤外毒性担忧，如Bajor等报道的对多种PD-L1⁺非恶性细胞系的细胞毒性效应。与人工工程化PD-L1特异性嵌合抗原受体（CAR）不同，本研究采用的生理性MHC限制性TCR特异性可能以较低功能亲和力和较高激活阈值运作，提供内在安全性机制。

## 研究结论

本研究提供PD-L1特异性TCR-T细胞的原理验证，突出其在体外靶向PD-L1表达癌细胞和免疫细胞的能力。通过将天然T细胞的生理性特异性与CRISPR-Cas9基因组编辑的精确性相结合，本工作代表了迈向临床前框架的初步步骤，支持进一步研究PD-L1靶向TCR策略的必要性。