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干扰素基因刺激因子（STING）是一种进化上保守的免疫信号蛋白，在宿主防御、癌症、衰老和炎症中起关键作用。在STING下游，I型干扰素、炎性细胞因子信号和非经典自噬受多层机制调控，该机制整合了配体诱导的结构转变、蛋白质-蛋白质相互作用和协调的细胞内运输。尽管S
干扰素基因刺激因子（STING）是一种进化上保守的免疫信号蛋白，在宿主防御、癌症、衰老和炎症中起关键作用。在STING下游，I型干扰素、炎性细胞因子信号和非经典自噬受多层机制调控，该机制整合了配体诱导的结构转变、蛋白质-蛋白质相互作用和协调的细胞内运输。尽管STING在免疫中处于核心地位且是重要的治疗靶点，但调控STING在细胞中（失）活化的序列元件仍未完全阐明。本研究开发了一种大规模并行检测方法，以系统绘制STING的序列-功能图谱。通过对数千个单氨基酸变体进行分析，研究人员确定了塑造STING免疫刺激能力及其将配体识别转化为不同信号输出的结构性和功能性决定因素。对选定的STING超活性变体进行的冷冻电子显微镜结构分析，揭示了决定STING从非活性状态向信号能力状态构象转变的新调控原理。突变效应在整个功能图谱中广泛存在，可以使STING对天然配体2′3′-cGAMP敏感，或将干扰素诱导与非经典自噬解耦，这展示了通过单点替换可以实现的多样化可能反应。最后，研究数据揭示了天然存在的STING蛋白变体的临床和进化相关性。总之，这些发现定义了调控STING活性的分子原理，并绘制了其在免疫背景下的功能潜力图谱。
**研究背景与意义**
干扰素基因刺激因子（STING）是先天免疫系统的核心信号转导蛋白，在感知胞质DNA、启动I型干扰素（IFN）和炎症反应中起关键作用。其异常激活与自身炎症性疾病（如STING相关婴儿期发病血管病，SAVI）相关，而功能丧失则可能影响抗肿瘤免疫。尽管已解析了STING的多种结构状态，但对其序列如何精确调控构象转变、信号输出多样性以及临床变体功能影响的理解仍不全面。发表在《自然》杂志的这项研究，通过系统性突变扫描，旨在全面绘制STING的序列-功能图谱，揭示其活化和信号分选的分子基础，为理解STING相关疾病的病理机制和开发靶向疗法提供了重要见解。
**关键技术方法**
研究人员主要采用了深度突变扫描（DMS）技术，在人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞中对STING蛋白进行位点饱和诱变，覆盖了所有可能的单氨基酸替换。利用基于I型干扰素反应元件和微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）脂化报告基因的流式细胞分选，高通量筛选并定量评估了各突变体在有无配体（如cGAMP或diABZI）刺激下的信号输出活性。结合冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析关键突变体的高分辨率结构，并利用STING1基因敲除的THP-1单核细胞系进行功能验证和转录组学（RNA-seq）分析，以在免疫相关背景下确认突变体的表型。临床变体分析整合了公共数据库（ClinVar, gnomAD, COSMIC）信息。
**研究结果**
**1. 自活性STING变体的发现**
通过饱和诱变筛选，研究人员在无配体条件下鉴定出大量能驱动I型干扰素报告基因表达的自活性功能获得性（GOF）变体。这些变体并非随机分布，而是聚集在特定的结构区域，包括连接跨膜结构域（TM）与配体结合结构域（LBD）的连接环、四聚体界面以及LBD本身。热点区域不仅与已知的SAVI相关突变重叠，还扩展了这些区域已知的突变和功能多样性。一些构成性活性变体定位在远离cGAMP结合位点的、先前未被识别的变构位点，例如TM1（K20）、连接TM3和TM4的内质网腔环（W119/M120）以及LBD内一个非结构化的C端环（E316/D319/D320）。cGAMP结合裂隙内的I165替换也标记为活性变体。个别测试证实了这些STING变体表达时具有强大的报告活性，且不改变总蛋白丰度。这些结果揭示了STING广泛分布的表型图谱，表明不同的结构区域共同贡献于对其干扰素信号潜能的精细分级控制。
**2. 自活性STING变体的结构机制**
通过冷冻电镜解析具有空间分散替换的变体结构，阐明了其驱动构成性下游信号的机制。对W119K/M120K突变体的分析揭示了其形成延伸的、弯曲的丝状寡聚体。两个赖氨酸替换中和了腔界面处的排斥力，并与同一二聚体单元中的E38和Y106形成新的静电接触，导致TM3和TM4的腔端向对立原体的TM1靠拢，并将TM3的胞质端向外位移。这种重排传递至LBD的旋转，产生一种构象，其TM与胞质结构域之间的连接子取向与cGAMP结合的STING结构非常相似。对D319K/D320K变体的结构分析则揭示了一种平面的寡聚组装，其中未改变的、类非活性状态的TM束与旋转的、类活性状态的LBD配对，形成一种不同于以往报道的STING构象。AlphaFold3建模提示，在非活性状态下，D319/D320环与相邻二聚体的酸性螺旋邻近，产生潜在的排斥接触，而在活性状态下，这种接触因cGAMP结合组装的弯曲几何形状而缓解。对I165H突变体的分析显示其二聚体类似于非活性状态STING，但局部结构变化促进了更闭合的LBD构象，并释放了连接子螺旋向TM区域的扭转，可能有助于STING的超活化。
**3. 抑制性STING变体的规模化鉴定**
将饱和诱变方法扩展至存在配体cGAMP的条件下，系统绘制了调控cGAMP启动反应的变体图谱。研究发现，位于STING腔末端的突变能选择性放大cGAMP存在下的干扰素信号，表明LBD在结构上与此区域通讯，以变构方式调节配体驱动的活化。相反，在cGAMP刺激下，功能丧失（LOF）变体映射到经典的调控特征区域，包括cGAMP结合口袋、覆盖cGAMP的盖子区域以及招募TBK1和IRF3所需的C端尾部基序。此外，还在残基I10、R14、E149以及残基78-80区域出现了两个额外的突变不耐受簇。通过比较实验性干扰素活性评分与计算预测的致病性评分，研究人员发现了一类预测为中性但在细胞中损害信号转导的LOF变体，这些位点富集于表面暴露的非结构化环区，其灵活性可能限制了当前结构模型的预测性能。
**4. 解耦STING依赖的干扰素和自噬反应**
通过整合配体诱导的LC3B脂化筛选数据与相应的干扰素值，研究人员构建了组合序列-功能图谱，解析了不同类别的信号行为。STING变体表现出广泛的活动范围，包括突变选择性增强或消除干扰素或LC3B反应的不同表型。分析揭示了由优先调控转录性（即干扰素）与非转录性（即LC3B脂化）输出的空间组织区域组成的离散功能簇。例如，C端尾部是干扰素缺陷变体的热点，与其在TBK1和IRF3招募中的作用及其对LC3B脂化的非必要性一致。研究人员还鉴定出选择性损害LC3B脂化同时保留干扰素活化的离散结构区域，这些区域定位于TM3、LBD尖端和相邻的C端螺旋。验证发现，TM3中的单个突变（L100E）几乎完全消除了STING诱导的LC3B结合，但在diABZI刺激后，干扰素活化保持完整。共聚焦显微镜显示，L100E STING形成配体诱导的灶状结构，但无法运输至内质网以外，从而阻止了LC3B脂化所需的膜重塑和质子流。这一发现表明，STING的寡聚化能力（而非亚细胞定位本身）决定了干扰素信号，而LC3B脂化严格需要内质网退出及随后的膜重塑。
**5. 结构状态与功能残基的交集**
将DMS测量数据与高分辨率非活性状态和cGAMP结合状态STING结构整合分析发现，功能残基（平均GOF > 0.25）结合了结构位移与相互作用重连。这些残基聚集在STING的两个相对极：腔区域和LBD。相比之下，经历大量接触重排但保持功能中性的残基主要位于连接区域和TM3等中间区域。这种空间组织表明，cGAMP诱导的STING活化是由位于蛋白质两极的机械耦合功能位点介导的，这些位点通过一个主要作为结构支架的中间残基网络连接，以传递整个分子的构象变化。
**6. 临床意义**
研究将变体筛选数据与ClinVar参考数据集整合，发现功能性干扰素评分能准确区分已知的良性或致病性分类变体。在意义未明的变体（VUS）中，数据集识别出位于已确立的SAVI热点内的替换，以及位于所有先前定义的SAVI位点之外的构成性活性STING变体W119C。交叉引用gnomAD条目与功能图谱，也提名了包括W119C和P317R在内的GOF变体。研究人员还鉴定出一例具有SAVI样临床表现的个体，携带罕见的杂合STING1变体c.956A>G (p.(Asp319Gly))。功能验证表明，D319G变体激活了STING信号的所有三个分支。对COSMIC数据库中体细胞突变的分析显示，癌症相关变体整体上向降低干扰素活性方向偏移，在cGAMP结合口袋和新发现的突变不耐受簇内富集LOF等位基因，提示cGAMP感知的减弱可能在肿瘤进化中赋予选择性优势。
**讨论与结论**
**讨论部分总结：**
本研究定义了STING的序列-功能图谱，揭示了其蛋白质结构处于高阶寡聚化边缘的精细平衡状态，这一设计原理既支持快速免疫激活，也易在扰动时发生自发信号传导。结构分析表明，不同的丝状几何形状与不同的信号状态相关。配体结合的STING采用适度弯曲的丝状体，而自活性的W119K/M120K变体形成高度弯曲的组装体，类似于激活的cGAMP结合构象，并能直接从内质网膜启动信号。相比之下，依赖于运输的D319K/D320K突变体组装成相对更直的寡聚体，可能代表一种启动但未完全激活的状态，需要在内质网后区室（如高尔基体或内溶酶体膜）中遇到不同的脂质成分和膜曲率才能转变为完全具有信号能力的结构。研究还提出了一个机制模型，解释STING如何从不同亚细胞区室协调不同的下游反应。I型干扰素信号传导、LC3B脂化和NF-κB激活的分离由两个交叉参数决定：STING丝状体的寡聚状态及其亚细胞定位。I型干扰素诱导主要由高曲率STING丝状体的形成控制，并不严格需要高尔基体转运。LC3B结合则依赖于STING到达内质网后区室。NF-κB激活要求最严格，需要高尔基体转运以及STING在反式高尔基网络中的充分积累以超过更高的激活阈值。这些发现将细胞内运输重新定义为不仅是一条STING活化途径，而且是一个能够根据丝状体几何形状和亚细胞再分布程度差异性地控制其转录和非转录输出的过程。此外，全面的变体图谱为解释天然存在的多态性和临床报告的意义未明变体提供了资源，基于工程化超活性变体为编程具有可调先天免疫特性的细胞状态和设计具有明确效应偏好的免疫传感器提供了机会。
**研究结论翻译：**
我们的研究定义了STING的序列-功能图谱，为理解单氨基酸变化如何重塑这一核心先天免疫衔接子的构象和信号特性提供了一个全面框架。超越先前表征的疾病相关等位基因和小鼠STING中一组有限的干扰素影响替换，我们的正向突变筛选揭示，STING蛋白质结构处于高阶寡聚化边缘的精细平衡状态：这一设计原理既支持快速免疫激活，也易在扰动时发生自发信号传导。超活性变体的结构分析进一步表明，不同的丝状几何形状与不同的信号状态相关。配体结合的STING采用适度弯曲的丝状体，而自活性的W119K/M120K变体形成高度弯曲的组装体，紧密类似于激活的cGAMP结合构象，并能直接从内质网膜启动信号。相比之下，依赖于运输的D319K/D320K突变体组装成相对更直的寡聚体，似乎代表一种启动但未完全激活的状态。这些组装体可能需要在内质网后区室（如高尔基体或内溶酶体膜）中遇到的独特脂质成分和膜曲率，才能转变为完全具有信号能力的结构。总之，这些发现表明，有效的STING信号传导不仅由寡聚化本身控制，还受丝状体组装精确几何形状及其与周围膜环境兼容性的调控。
并行地，我们的突变数据为理解STING如何从不同亚细胞区室协调不同的下游反应提供了一个机制模型。I型干扰素信号传导、LC3B脂化和NF-κB激活的分离由两个交叉参数决定：STING丝状体的寡聚状态及其亚细胞定位。I型干扰素诱导主要由高曲率STING丝状体的形成控制，并不严格需要高尔基体转运，正如W119K/M120K变体所示，它能从内质网有效触发干扰素信号，同时仅显示有限的前向运输。相比之下，LC3B结合依赖于STING到达内质网后区室，然而这一要求甚至可以通过微小的转运蛋白部分来满足，这与布雷菲德菌素A消除LC3B脂化但不消除W119K/M120K下游的干扰素诱导一致。NF-κB激活施加了最严格的要求：它需要高尔基体转运以及STING在反式高尔基网络中的充分积累以超过更高的激活阈值。这直接得到了运输缺陷的L100E突变体的支持，该突变体在配体刺激下能强力激活I型干扰素但无法诱导NF-κB。总之，这些发现重新定义了细胞内运输不仅是一条STING活化途径，而且是一个能够根据丝状体几何形状和亚细胞再分布程度差异性地控制其转录和非转录输出的过程。
除了阐明机制原理，我们全面的变体图谱合理解释了天然存在的多态性和临床报告的意义未明变体，为解释其功能影响提供了资源。从合成生物学角度来看，本文描述的工程化超活性变体为编程具有可调先天免疫特性的细胞状态和设计具有明确效应偏好的免疫传感器提供了机会。我们的工作建立了一种可扩展的策略来解码免疫信号蛋白的分子原理，并说明了深度突变询问如何揭示调控宿主防御系统活化和调控的内在规则。更广泛地说，我们的方法创建了一个将突变扰动与细胞表型联系起来的高分辨率图谱，为我们对蛋白质功能的理解提供了新的维度，可用于研究许多其他蛋白质在其细胞背景下的功能。
