小分子对β-抑制蛋白的调控作用

《Nature》：Small-molecule modulation of β-arrestins

　　

β-抑制蛋白是G蛋白偶联受体（GPCR）信号的多功能调节因子，在整个GPCR超家族中协调多种下游信号事件和生理反应^1,2,3。尽管GPCR药理学已发展到能够靶向正构位点和变构位点，以及G蛋白和GPCR激酶（GRKs），但直接调控β-抑制蛋白活性的化学工具仍然明显缺乏。本文报道了选择性靶向β-抑制蛋白的小分子抑制剂的发现，并通过整合的药理学、生物化学、生物物理学和结构分析阐明了其作用机制。这些抑制剂破坏了β-抑制蛋白与激动剂激活的GPCRs的结合，损害了受体的脱敏、内化和β-抑制蛋白依赖性生理功能，同时不影响G蛋白-受体偶联。冷冻电子显微镜（cryo-EM）、分子动力学模拟和结构引导的诱变揭示，一种调节剂Cmpd-5结合在β-抑制蛋白1中央峰内的一个口袋，该口袋由中间环、C环和套索环（一个关键的受体结合界面）形成，稳定了一种与β-抑制蛋白-受体完全结合不相容的独特构象。总之，这些发现为β-抑制蛋白的调控建立了一个机制框架，揭示了一个用于基于结构的药物设计的新型变构位点，并为靶向转导蛋白、通路特异性的GPCR治疗剂开辟了新途径。

**论文解读：小分子靶向β-抑制蛋白的机制与功能研究**

**一、 研究背景与意义**

G蛋白偶联受体（GPCR）是人类中最重要的跨膜受体家族，包含超过800个基因，约三分之一的美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物的作用靶点与此相关。β-抑制蛋白是GPCR信号传导的关键调节枢纽，在GPCR脱敏、内吞和信号通路调控中扮演核心角色。哺乳动物抑制蛋白家族包括两个广泛表达的亚型：β-抑制蛋白1（βARR1）和β-抑制蛋白2（βARR2），以及两个视觉抑制蛋白。当GPCR被激动剂激活后，会与异源三聚体G蛋白相互作用并激活之，触发第二信使产生和下游信号传导。随后，GPCR激酶（GRKs）对激动剂激活的受体（主要在羧基末端尾部）进行磷酸化，使β-抑制蛋白得以结合受体。这种结合在空间上阻碍了进一步的G蛋白相互作用，导致受体脱敏、G蛋白介导的下游信号通路减弱，以及通过网格蛋白包被小窝进行的受体内化。

除了在信号终止中的传统作用，β-抑制蛋白还作为多功能信号转导单元，独立或与G蛋白协同参与多种信号级联反应。在此过程中，它们作为支架并变构调节多种下游效应器，促进与包括MAP激酶（MAPKs）、原癌基因激酶SRC、NF-κB、AKT（也称为蛋白激酶B）和MDM-p53等信号介质，以及内吞机制的各种组分的相互作用。它们参与许多生物过程，包括基因表达、代谢、免疫功能、运动和细胞凋亡。因此，β-抑制蛋白信号失调与多种疾病相关，包括癌症、炎症和自身免疫性疾病、代谢综合征、心血管疾病和神经系统疾病。尽管β-抑制蛋白作用如此关键，但与此形成对比的是，对于G蛋白和GRKs等GPCR转导蛋白已有许多调节剂，而据研究人员所知，目前尚无直接靶向β-抑制蛋白的药理学制剂。因此，对β-抑制蛋白的研究仍然依赖于繁琐的遗传模型和动物系统。这些局限性凸显了需要化学策略来探测和调控β-抑制蛋白活性。本研究发表在《Nature》杂志上，报道了首批结合并抑制β-抑制蛋白的小分子的发现，并通过整合的结构、计算和功能分析阐明了其作用机制。这些发现为选择性调控β-抑制蛋白介导的GPCR信号建立了机制框架，具有重要的科学意义和潜在的治疗应用前景。

**二、 主要关键技术方法**

为开展研究，研究人员建立了一个多层次的发现流程，主要关键技术方法包括：1. 利用差示扫描荧光法（DSF）筛选了来自美国国家癌症研究所（NCI）多样性集的3500种化学多样性化合物，以评估其与纯化βARR1/2的相互作用，初步命中基于热位移进行识别。2. 采用药理学测定（如使用放射性标记的β₂肾上腺素能受体（β₂AR）激动剂[³H]-4-甲氧基非诺特罗（[³H]-Fen）结合测定）和基于化学发光的βARR2招募测定（PathHunter）来评估候选化合物对β-抑制蛋白依赖活性的影响。3. 使用等温滴定量热法（ITC）测量调节剂与βARR1/2的直接结合亲和力。4. 利用活细胞生物传感器（如基于FRET的cAMP传感器和钙离子指示剂）实时监测第二信使动态，以评估调节剂对受体脱敏的影响。5. 采用冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析了βARR1与调节剂Cmpd-5的复合物结构，并结合分子动力学模拟和结构引导的定点诱变来阐明其分子机制。研究中使用的细胞模型包括HEK293、U2OS细胞以及CRISPR-Cas9敲除βARR1/2的HEK293细胞系，受体模型涵盖了多种GPCRs（如β₂AR、AT1R、GLP-1R等）。

**三、 研究结果**

**1. β-抑制蛋白调节剂的鉴定**
通过DSF筛选和功能验证，研究人员鉴定出三种化学结构不同的调节剂：Cmpd-5（又名冬凌草甲素）、Cmpd-46和Cmpd-64。这些化合物在正交测定中均表现出稳健的抑制活性，能剂量依赖性地抑制异丙肾上腺素（Iso）诱导的βARR2向β2V2R的招募，最大抑制率分别达到77.0%、77.3%和74.4%。ITC分析证实它们直接结合βARR1/2，解离常数（K_d）在数百纳摩尔至低微摩尔范围。系统分析表明，这些调节剂选择性作用于β-抑制蛋白，对经典Gα亚家族（Gα_s、Gα_q、Gα₁₂）无明显影响，也不抑制G_i蛋白活性。

**2. β-抑制蛋白调节剂抑制β-抑制蛋白的招募**
评估了这些调节剂在跨越不同受体家族和偶联模式的多种GPCRs（包括AT1R、V2R、CXCR3、NTSR1、β₁AR、μOR、M2R、ACKR3和GLP-1R）中对β-抑制蛋白招募的影响。所有三种调节剂均能产生稳健但受体依赖性的βARR1/2招募抑制（抑制率35–94%）。例如，在AT1R上，它们显著抑制了血管紧张素II（ANGII）诱导的βARR2招募；在ACKR3和GLP-1R上，也观察到了类似的抑制效果。雷达图总结了对所有受体的标准化抑制，突出了调节剂跨GPCR类别的广泛但机制不同的作用。

**3. 对脱敏和内化的抑制**
β-抑制蛋白调节剂破坏了β-抑制蛋白-GPCR偶联，从而阻止受体脱敏。在稳定表达β₂AR的HEK293细胞中，所有调节剂均抑制了β₂AR脱敏，相对于DMSO对照，持续并增强了激动剂诱导的cAMP积累。在稳定表达AT1R的HEK293细胞中，调节剂同样显著抑制了AT1R脱敏，增强了Gα_q介导的Ca²⁺信号。在βARR1/2敲除细胞中，这种调节效应消失，证实了其β-抑制蛋白依赖性。此外，调节剂还显著减少了Iso诱导的β2V2R–βARR2的内化，最大抑制率在25 μM时分别达到93%（Cmpd-5）、88%（Cmpd-46）和87%（Cmpd-64）。使用旁观者BRET测定V2R向早期内体的运输，也验证了调节剂能减弱这一反应。

**4. 对下游信号和生理功能的影响**
β-抑制蛋白调节剂选择性干扰GPCR激活下游的β-抑制蛋白依赖性信号。它们显著减弱了由卡维地洛（一种β-抑制蛋白偏向性激动剂）诱导的、下游β₂AR的βARR1/2依赖性ERK激活，但不影响表皮生长因子（EGF）诱导的ERK激活。下拉实验显示，所有调节剂均显著减少了βARR1与SRC和ERK2的结合，但不影响与JNK3的相互作用。在生理功能层面，调节剂破坏了CCL19刺激的野生型小鼠T细胞迁移，在20 μM时对CD4+辅助性T细胞等群体产生近乎完全的抑制。在分离的成年小鼠心室心肌细胞中，β-抑制蛋白偏向性配体TRV027显著增强了肌节缩短、收缩速度和松弛速度，而预处理Cmpd-5、Cmpd-46或Cmpd-64则显著抑制了这些效应，将收缩参数降低至接近基线水平。

**5. 抑制的结构和分子机制**
冷冻电镜解析了βARR1–Cmpd-5复合物的结构，分辨率达3.47 ?。Cmpd-5定位于βARR1中央峰内的一个独特口袋，该口袋由中间环（残基129–140）、C环（残基241–249）和套索环（残基274–300）形成，统称为MCL位点。与结合GPCR磷酸化C末端的经典N域沟槽不同，MCL位点代表一个空间和结构上不同的口袋。在apo状态的结构中，MCL位点没有观察到密度，这与Cmpd-5结合复合物形成鲜明对比，为化合物占据提供了明确证据。分子动力学模拟证实了Cmpd-5稳定地驻留在MCL位点内，周围的环表现出动态灵活性。绝对结合自由能微扰计算估计结合自由能为-4.1 ± 0.1 kcal mol^-1，与实验结合亲和力一致。基于冷冻电镜结构的定点诱变验证了介导Cmpd-5识别的关键残基（如L129、P133、E134、Y249、C251、R285等），这些残基的突变降低了Cmpd-5的结合亲和力和功能抑制活性。

**6. 独特的抑制剂结合构象状态**
结构比较表明，Cmpd-5的结合诱导了中央峰的显著重排，并伴有约8°的轻微域间旋转。与V2Rpp结合的活性状态相比，Cmpd-5结合状态在中央峰存在明显差异。在典型的活性β-抑制蛋白构象中，MCL位点扩展以容纳包括细胞内环2（ICL2）在内的受体元件，这是由中间环位移和约20°的域间扭转驱动的。相比之下，Cmpd-5促进中间环向C域弯曲，重新定位其尖端以覆盖和收缩MCL口袋，同时伴随着C环的位移和套索环（残基282–285）的螺旋到环的转变，共同产生了约8°的适度域间扭转，这与完全活性状态不同。这种重排使中间环的后向弯曲更靠近指状环，可能导致其灵活性增加。这些协调的重排与Cmpd-5稳定了一种限制GPCR在核心和尾部受体界面结合的β-抑制蛋白构象的观点一致。来自结构叠加、DSF分析和活细胞生物传感器的证据共同表明，Cmpd-5将βARR1驱动到一种不同于活性和基础状态（但更接近基础状态）且与完全受体结合不相容的构象。

**四、 讨论与结论**

**讨论部分总结：**
β-抑制蛋白在调节多种GPCR信号通路中具有核心作用，影响生理功能和病理生理过程。其功能主要通过基因方法（如敲除、基因沉默和CRISPR-Cas9编辑）以及间接药理学策略进行研究，但这些方法缺乏可逆性、时间精确性或所需的选择性。本研究报道了直接靶向β-抑制蛋白的小分子抑制剂，通过选择性解偶联β-抑制蛋白与受体，调节剂减弱了受体脱敏，从而维持了G蛋白信号并延长了β₂AR–Gα_s和AT1R–Gα_q偶联下游的第二信使反应。这种功能解偶联在β-抑制蛋白介导的脱敏本身有害的背景下可能具有治疗意义。此外，β-抑制蛋白协调GPCR相关信号复合物以介导G蛋白非依赖性通路，包括ERK1/2激活。所有三种调节剂均抑制了β-抑制蛋白依赖性ERK激活，并将抑制作用扩展到β-抑制蛋白介导的趋化因子诱导的T细胞迁移和心肌细胞收缩性。这些发现强调了β-抑制蛋白广泛的生理影响，并确立了这些调节剂作为探究β-抑制蛋白调控信号的化学探针。结构分析整合了冷冻电镜、分子动力学模拟、诱变和构象生物传感器，形成了一个统一模型：Cmpd-5利用MCL位点，这是一个与活性β-抑制蛋白的ICL2结合受体界面关键重叠的口袋。Cmpd-5稳定了一种独特的构象，限制了完全β-抑制蛋白激活所需的域间灵活性，支持了一种变构抑制机制。MCL位点在两种β-抑制蛋白亚型中的保守性表明了一种共享的结合模式。

**研究结论翻译：**
在发现β-抑制蛋白的小分子抑制剂并阐明其结构和机制基础的过程中，这项工作揭示了一个先前未表征的、对β-抑制蛋白–GPCR结合至关重要的变构口袋。除了引入探究β-抑制蛋白生物学的化学工具外，这些发现还标志着从受体中心药理学向细胞内转导蛋白直接调节的概念转变，为以通路水平精度选择性调控GPCR信号开辟了一条新途径。