《Nutrients》：Maltol Protects Neuronal Cells by Alleviating Chronic Neuroinflammation, Pyroptosis, and Ferroptosis via HSP70 Upregulation in Microglia
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目的：神经炎症被认为是阿尔茨海默病（AD）的重要特征。目前，尚缺乏有效的药理学手段预防或治疗与AD相关的神经炎症过程。热休克蛋白70（HSP70）在神经炎症进展中具有关键作用。本研究中，研究人员探讨了麦芽酚——一种源自红参的美拉德反应产物——作为神经炎症治疗药
目的：神经炎症被认为是阿尔茨海默病（AD）的重要特征。目前，尚缺乏有效的药理学手段预防或治疗与AD相关的神经炎症过程。热休克蛋白70（HSP70）在神经炎症进展中具有关键作用。本研究中，研究人员探讨了麦芽酚——一种源自红参的美拉德反应产物——作为神经炎症治疗药物的潜力。方法：体外实验建立了HMC3小胶质细胞模型，以考察梯度浓度麦芽酚（12.5、25、50 μM）对TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路、神经炎症及焦亡的调控作用。通过GEO数据库分析和基因集富集分析（GSEA）鉴定麦芽酚的核心靶点，随后进行HSP70基因沉默实验以验证靶向调控机制。结果：麦芽酚显著减轻了脂多糖（LPS）诱导的小鼠神经元损伤和认知缺陷，有效抑制了小胶质细胞介导的神经炎症和焦亡，逆转了氧化应激诱导的神经元铁死亡，并抑制了神经元凋亡。体外实验表明，麦芽酚阻碍了TLR4/MyD88结合，从而抑制NF-κB p65介导的神经炎症和焦亡，同时缓解过量活性氧（ROS）蓄积以增强氧化应激和铁死亡。生物信息学分析鉴定HSP70为麦芽酚抗炎和抗氧化效应的关键靶点。后续基因沉默实验证实，麦芽酚以HSP70依赖性方式发挥其对LPS诱导的神经炎症和焦亡的抑制作用。结论：麦芽酚通过靶向HSP70，对AD相关神经炎症、氧化应激、焦亡和铁死亡表现出显著的保护效应。本研究阐明了麦芽酚改善神经炎性损伤的分子机制，为利用中药干预AD神经炎症提供了新的理论基础和防治策略。
阿尔茨海默病（AD）是一种以细胞外淀粉样β（Aβ）肽沉积和细胞内Tau蛋白异常聚集为特征的不可逆神经退行性疾病，神经炎症作为AD发生发展的关键因素，与淀粉样病理相互作用，促进Tau蛋白形成与扩散，最终导致神经元凋亡和认知功能衰退。小胶质细胞作为中枢神经系统内的专职巨噬细胞，其介导的神经炎症反应与神经元损伤和认知缺陷密切相关。近年来研究表明，小胶质细胞焦亡在神经炎症中具有重要贡献，而衰老、神经炎症及活性氧（ROS）过量产生均可导致氧化应激和神经元细胞凋亡。铁死亡（Ferroptosis）作为一种由铁依赖性磷脂氧化特征的独特细胞死亡形式，受多种细胞代谢途径调控，与器官损伤及退行性疾病密切相关。热休克蛋白（HSPs）是生物体应对环境物理、化学、生物及精神刺激而合成的蛋白质，其中HSP70（Heat Shock Protein 70）在几乎所有经历生物应激的细胞中均被上调表达，发挥分子伴侣功能，增强应激细胞耐受性，加速正常蛋白合成恢复，并可抑制炎症细胞的凋亡和氧化应激。近期研究揭示，HSP70水平升高可通过抑制NLRP3激活及其后续炎症反应维持免疫系统平衡。麦芽酚（3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone）是一种天然吡喃类化合物，广泛存在于落叶松、冷杉、甘草、甜桦、木兰等天然植物中，也是鲜人参蒸制加工为红参过程中的美拉德反应产物，具有显著的物理化学性质及对微量金属离子的强亲和力。前期研究表明麦芽酚具有延缓脑衰老、改善肠道炎症、保护肝肾等抗氧化和抗凋亡作用，但关于其抗炎效应的研究较少。
本研究基于麦芽酚的强生物活性及研究基础，建立了体外和体内LPS诱导的神经炎症模型，旨在探讨麦芽酚对慢性神经炎症的保护效应及其分子机制，为改善慢性神经炎症的研究提供重要的理论框架。该研究发表于《Nutrients》期刊。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：构建LPS诱导的C57BL/6J小鼠神经炎症模型（7-8周龄雄性，辽宁长生实验动物有限公司提供，质量合格证号SCXK（辽）2020-0001），通过八臂放射状迷宫实验评估空间记忆能力，采用H&E染色和Nissl染色进行脑组织病理学观察；建立人小胶质细胞系HMC3（由吉林大学白求恩基础医学院提供）体外培养模型，使用MTT法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡率，DCFH-DA荧光探针检测ROS水平，免疫荧光（IF）染色检测CD206和HSP70表达，免疫组化（IHC）染色检测NLRP3和caspase-1；利用免疫共沉淀（Co-IP）技术分析TLR4与MyD88蛋白相互作用；通过ELISA试剂盒检测IL-1β和TNF-α炎症因子水平，商业试剂盒检测MDA、SOD、CAT等氧化应激指标；借助GEO数据库（GSE122063数据集，含56例AD患者和44例对照样本）进行差异基因分析和GSEA富集分析；采用小干扰RNA（siRNA）技术对HSP70进行基因沉默；通过Western blot检测多种信号通路蛋白表达。
研究结果部分如下：
**麦芽酚改善小鼠记忆丧失并缓解AD样症状**
通过连续14天LPS刺激建立神经炎症模型后，八臂迷宫行为学测试显示模型组小鼠潜伏期时间和总运动距离显著增加，表明记忆能力下降；麦芽酚（50 mg/kg和100 mg/kg）和多奈哌齐（2 mg/kg，作为阳性对照）给药后小鼠记忆能力显著改善。H&E染色显示模型组海马CA3区神经元结构松散、密度显著降低，Nissl染色显示神经元排列紊乱、Nissl小体数量减少，麦芽酚和多奈哌齐有效缓解上述病理改变。Western blot检测表明模型组脑源性神经营养因子（BDNF）表达显著降低、Tau蛋白异常磷酸化，麦芽酚和多奈哌齐可显著逆转这些变化。
**麦芽酚减少LPS诱导的凋亡体外和体内**
在HMC3细胞中，LPS（100 ng/mL）联合尼日利亚菌素（Nig，30 μM）刺激24小时后细胞活力降至78%，成功建立细胞损伤模型。麦芽酚在12.5-50 μM浓度范围内可显著改善细胞活力，保护效应在50 μM达到饱和。流式细胞术显示模型组凋亡率为21.64%，麦芽酚处理后呈剂量依赖性降低。Western blot检测表明模型组cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达升高，Bcl-2表达降低，麦芽酚和多奈哌齐可逆转这些趋势。体内实验获得一致结果。研究人员指出，LPS诱导的HMC3细胞活力下降并非由单一细胞死亡模式调控，而是细胞凋亡、小胶质细胞焦亡和铁死亡共同介导。
**麦芽酚抑制LPS诱导的神经炎症体外和体内**
免疫荧光显示模型组海马皮层区CD206（M2型巨噬细胞标志物）荧光强度显著增加，表明小胶质细胞激活，麦芽酚和多奈哌齐可逆转这一现象。ELISA检测显示模型组HMC3细胞和培养上清中IL-1β、TNF-α水平显著升高，麦芽酚和多奈哌齐可抑制其产生。Western blot显示LPS增加p-NF-κB p65和p-IKKβ表达，麦芽酚和多奈哌齐处理后缓解，提示麦芽酚通过抑制NF-κB p65介导的神经炎症发挥抗炎作用。
**麦芽酚通过抑制TLR4/MyD88结合缓解LPS诱导的神经炎症和焦亡**
免疫组化显示模型组海马CA1区NLRP3和caspase-1阳性颗粒显著增加，提示NLRP3炎症小体激活，麦芽酚和多奈哌齐可逆转。Western blot检测到模型组NLRP3、HMGB1、cleaved-caspase-1、GSDMD/GSDMD-N、ASC和cleaved-caspase-11表达升高，麦芽酚处理后显著下调。Co-IP结果表明模型组TLR4与MyD88结合增强，麦芽酚可减轻这种结合，提示麦芽酚通过促进TLR4/MyD88解离，抑制NF-κB p65激活，从而缓解神经炎症和焦亡。
**麦芽酚改善氧化应激和铁死亡体外和体内**
DCFH-DA荧光染色显示LPS显著增加HMC3细胞ROS过产生，麦芽酚显著降低ROS荧光强度。生化分析表明模型组脑组织CAT和SOD活性显著降低，MDA水平显著升高。Western blot显示麦芽酚有效缓解LPS诱导的Nrf2和HO-1氧化应激相关蛋白变化。关于铁死亡，模型组GPX4和SLC7A11蛋白表达显著降低，NOX4表达增加，麦芽酚处理后可逆转这些变化，提示麦芽酚通过Nrf2/GPX4轴缓解LPS诱导的氧化应激和铁死亡。
**麦芽酚增强HSP70表达体外和体内**
对GEO数据库GSE122063数据集的差异分析显示341个基因上调、559个基因下调。GSEA分析表明HSP70基因与神经炎症、谷氨酸能信号通路和氧化应激反应信号通路相关。Western blot和免疫荧光显示模型组HMC3细胞和脑组织中HSP70表达显著降低，麦芽酚处理显著增加其表达水平，提示麦芽酚可能通过上调HSP70表达发挥神经保护作用。
**麦芽酚通过增加HSP70表达水平阻断炎症和小胶质细胞焦亡**
为验证HSP70在麦芽酚神经保护中的作用，研究人员在HMC3细胞中使用siRNA（20 nM）沉默HSP70基因，使HSP70蛋白表达下调80%。免疫荧光显示，与阴性对照组相比，HSP70沉默后麦芽酚处理未能缓解LPS+Nig诱导的NF-κB p65激活。Western blot进一步证实，在HSP70缺失条件下，麦芽酚不能抑制p-NF-κB p65、p-IKKβ磷酸化，也不能降低NLRP3、GSDMD/GSDMD-N、cleaved-caspase-1的表达。这些结果表明HSP70是麦芽酚改善LPS介导的神经炎症和焦亡的关键靶点。
讨论部分总结：
研究人员首先阐述了神经炎症在AD早期阶段的重要性，指出产生Tau的神经元可通过招募小胶质细胞并促进促炎因子和趋化因子释放来触发神经炎症，加剧疾病进展。基于前期研究发现麦芽酚可延缓脑衰老和改善肠道炎症反应，研究人员假设麦芽酚可能具有改善LPS诱导神经炎症的潜力，并通过本研究首次加以验证。
研究发现麦芽酚增强了小鼠的记忆学习能力，抑制了HMC3细胞凋亡，缓解了氧化应激诱导的铁死亡，并通过上调HSP70表达缓解了HMC3细胞的炎症和焦亡。连续14天LPS注射后，行为学测试、病理染色及BDNF、Tau蛋白表达变化共同验证了神经炎症模型的成功建立；麦芽酚和多奈哌齐治疗后各项指标均得到不同程度改善。
关于凋亡机制，研究人员评估了Bcl-2家族相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3）和caspase-8的表达水平，发现麦芽酚能有效逆转LPS诱导的凋亡，并通过流式细胞术进一步证实。在神经炎症方面，CD206免疫荧光显示LPS刺激后小胶质细胞激活，促炎因子TNF-α和IL-1β释放增加，麦芽酚处理后可缓解这些现象，并逆转NF-κB p65和IKKβ蛋白的激活。
关于焦亡机制，研究人员指出焦亡是由GSDMD介导的程序性细胞死亡类型，本研究采用尼日利亚菌素联合LPS诱导HMC3细胞焦亡模型，证实麦芽酚能有效减少NLRP3激活引起的caspase-1经典途径和caspase-11非经典途径的激活。TLR4作为识别危险相关分子模式（DAMPs）和病原体相关分子模式（PAMPs）的重要模式识别受体，在LPS诱导的焦亡中发挥关键作用；麦芽酚通过破坏TLR4/MyD88结合抑制NF-κB p65和NLRP3激活，从而缓解炎症和焦亡。
关于氧化应激与铁死亡，研究人员检测了Nrf2、HO-1等氧化应激相关蛋白及SOD、CAT抗氧化酶活性和MDA水平，表明麦芽酚具有抗氧化效应。GPX4、SLC7A11和NOX4等铁死亡相关蛋白的检测结果提示，麦芽酚可能缓解LPS诱导的氧化应激触发的铁死亡。
为深入评估麦芽酚的作用靶点，研究人员利用GEO数据库鉴定差异基因，GSEA富集分析发现HSP70与氧化应激和神经炎症反应高度相关。结合文献报道HSP70在Tau解聚和折叠及调控小胶质细胞炎症反应中的作用，研究人员推测麦芽酚可能通过HSP70发挥一系列神经保护效应。HSP70表达检测结果与推测基本一致，而HSP70基因沉默实验进一步证实，缺失HSP70后麦芽酚无法缓解NF-κB p65/NLRP3介导的神经炎症和焦亡，表明麦芽酚通过增加HSP70蛋白表达水平发挥抗炎和抗焦亡作用。由于焦亡仅在HMC3小胶质细胞中检测到而非在神经元中，研究人员认为麦芽酚主要通过抑制小胶质细胞焦亡和神经炎症间接减少继发性神经元损伤和凋亡，从而实现神经元保护。研究人员同时指出，麦芽酚对Tau和BDNF的调控可能并非仅由HSP70上调单独介导，抗神经炎症、抗氧化应激及相关上游信号通路调控也可能共同参与，有待进一步研究阐明。
研究结论：本研究建立了LPS诱导的神经炎性阿尔茨海默病体外和体内模型，探讨了麦芽酚对小胶质细胞炎症、焦亡和氧化应激等信号通路的改善作用。通过GEO数据库筛选出差异基因HSP70，并利用基因沉默技术研究了麦芽酚通过增加HSP70表达水平抑制炎症和焦亡的效应，这可能为寻找治疗AD的新药提供新的方向和理论依据。研究人员表示，未来将进一步探索HSP70作为重要分子伴侣如何改善神经炎症引起的蛋白非结构化区域结合异常。
