A型肉毒毒素治疗特发性眼睑痉挛的效应：一项临床与神经生理学探索性研究的证据

《Toxins》：Effects of Botulinum Toxin Type A in Essential Blepharospasm: Evidence from a Clinical and Neurophysiological Pilot Study

　　

特发性眼睑痉挛（essential blepharospasm, BEB）是一种局灶性肌张力障碍，其特征为脑干兴奋性异常及三叉神经-面神经环路内抑制性控制受损。A型肉毒毒素（botulinum toxin type A, BoNT-A）作为已确立的一线治疗方法，主要作用于神经肌肉接头。然而，BoNT-A是否也能调控BEB患者的中枢脑干环路尚不明确，且专门的神经生理学研究结果存在分歧。本研究旨在利用瞬目反射恢复周期探讨BoNT-A是否能调控BEB患者的脑干中间神经元兴奋性，并将临床结局与神经生理学结果进行相关性分析。13例BEB患者在BoNT-A治疗前（T0）及治疗后1个月（T1）接受了神经生理学和临床评估。瞬目反射恢复周期在刺激间期（interstimulus interval, ISI）为200、300、500和1000 ms时进行评估。临床严重程度采用BSPSS、JRS和BDS量表评估。治疗后，R2波幅比值在所有ISI下均出现具有统计学意义的降低（所有p ≤ 0.001），提示脑干中间神经元兴奋性降低。所有临床量表在治疗后均显示具有统计学意义的改善（BSPSS、JRS、BDS；所有p < 0.001）。本项探索性研究提供了初步证据，表明BoNT-A治疗可能降低BEB患者的脑干中间神经元兴奋性，这一点通过瞬目反射恢复周期的R2波幅比值出现显著且一致的降低而得以证实。这些发现与BoNT-A除其确立的外周作用之外还存在中枢调控效应的观点一致。尚需更大规模的对照研究来证实这些结果。

特发性眼睑痉挛（essential blepharospasm, BEB）是一种患病率可达133/100万的局灶性肌张力障碍，以眼轮匝肌不自主双侧收缩为特征，导致功能性视力损害和生活质量显著下降。尽管其临床特征明确，但潜在病理生理机制——特别是外周与中枢神经功能障碍的相对贡献——仍未完全阐明。现有证据支持基底节-脑干环路功能障碍参与BEB发病，导致抑制性控制受损和脑干中间神经元网络兴奋性增高。特别是，三叉神经-面神经通路内异常的感觉运动整合被认为是关键病理生理机制，导致传入输入处理改变和脑干水平抑制降低。感觉 tricks（感觉诡计）可部分抑制痉挛的临床观察进一步支持了BEB中感觉处理异常的作用。

神经生理学研究为这些机制提供了重要洞见。瞬目反射（blink reflex）是研究三叉神经-面神经环路功能完整性的成熟实验模型。瞬目反射包含早期同侧R1反应（由少突触脑桥通路介导）和较晚的双侧R2反应（依赖于脑干内多突触中间神经元环路）。BEB患者中R1潜伏期的改变也被报道，进一步支持脑干环路在多层面的参与。此外，R2成分的恢复周期被广泛用于评估抑制性处理：在健康受试者中，短刺激间期（interstimulus interval, ISI）时第二个R2反应受到明显抑制，而BEB患者中这种抑制减弱，反映了中间神经元兴奋性增高和抑制性控制缺陷。

A型肉毒毒素（BoNT-A）是BEB的确立一线治疗方法，主要通过裂解SNAP-25抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放而发挥 primary 效应。在多种BoNT-A制剂中，onabotulinumtoxinA是临床实践中最广泛用于包括BEB在内的各种肌张力障碍治疗的制剂，在多个注射周期中具有良好的安全性和疗效特征。汇聚的实验证据表明，BoNT-A效应可能超越外周突触。动物研究已证明毒素可经轴突逆向运输至运动神经元胞体，并跨突触扩散至二级神经元，在远离注射位点的中枢突触末梢产生 SNAP-25裂解。这些发现提出了BoNT-A可能调控中枢神经环路的假说，可能通过神经肌肉阻滞以外的机制贡献其临床疗效。

尽管存在这些观察，BoNT-A是否调控BEB患者的脑干中间神经元兴奋性仍存在争议。Valls-Solé等和Grandas等发现BoNT-A治疗后瞬目反射恢复周期参数无统计学显著变化，而其他研究组则报告脑干抑制功能部分正常化。这些分歧可能反映了方法学异质性，包括注射方案差异、治疗后评估时机不同，以及最重要的是使用绝对R2波幅而非波幅比值作为结局指标——这可能混淆外周与中枢效应。本研究旨在通过评估治疗前后瞬目反射恢复周期的变化，检验BoNT-A是否能降低BEB患者异常的脑干中间神经元兴奋性。R2波幅比值被选为主要结局指标，因其可校正外周神经肌肉效应，可能比绝对R2波幅更特异性地检测中枢调控。

本研究招募了13例确诊BEB患者，均在意大利乌迪内大学临床神经科接受慢性BoNT-A治疗。所有患者在基线评估前至少停用BoNT-A 5个月以确保疾病状态恢复至基线。排除标准包括继发性眼睑痉挛、其他影响脑干功能的神经系统疾病，以及使用可能干扰神经生理学评估的药物（如抗胆碱能药、苯二氮?类和抗痉挛药）。这是一项纵向观察性研究，患者在BoNT-A注射前（T0）及治疗后1个月（T1）进行评估。1个月时间点被选为评估时点，因其对应BoNT-A的峰值临床效应，并允许潜在中枢神经调控效应充分显现，与轴突逆向运输的时间进程实验证据一致。所有患者由经验丰富的神经科医师使用onabotulinumtoxinA进行治疗，注射方案针对眼轮匝肌睑板前部双侧，必要时追加至眼眶部眼轮匝肌和皱眉肌；每例患者总剂量为46.9 ± 13.2 U（范围：26–68 U）。神经生理学评估采用标准化条件下的瞬目反射记录，使用Dantec Keypoint? G4肌电图仪，带通滤波2 Hz–10 kHz，增益0.2 mV/div，扫描速度5 ms/div。双侧眶上神经电刺激采用表面电极，刺激强度达超最大强度（最高30 mA），脉宽0.2 ms，随机化刺激频率。记录双侧眼轮匝肌活动。每次试验前确认肌肉松弛（等电位基线肌电图活动）；存在预激活或自发眼轮匝肌活动的试验被排除并重复。瞬目反射恢复周期采用200、300、500和1000 ms ISI的双脉冲刺激评估。每个ISI记录2次试验并取平均——此数量被认为足以验证反应可重复性同时最小化R2成分的习惯化风险。R2成分峰-峰波幅测量采用自动分析并由经验丰富的神经生理学家手动校正，该专家对患者临床评分和记录时点（T0 vs. T1）设盲。R2波幅比值计算为条件化R2波幅与非条件化R2波幅之比。临床严重程度采用三种经验证的量表评估：BSPSS（眼睑痉挛严重程度评定量表，评估痉挛频率和强度）、JRS（Jankovic评定量表，评估肌张力障碍运动严重程度和频率）和BDS（眼睑痉挛残疾量表，量化日常活动功能损害）。所有临床评估由对神经生理学结果设盲的运动障碍专科医师完成。统计学分析采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态分布；t检验或Mann–Whitney检验用于连续变量比较；重复测量方差分析（ANOVA）用于考察不同ISI下R2波幅比值在T0和T1的变化及差异，因Mauchly检验提示球性假设违反，采用Greenhouse–Geisser校正；Bonferroni事后检验用于不同时点均数比较。数据集完整，无缺失值。所有分析采用Stata/SE 15.1版完成，双侧检验显著性水平设为p < 0.05。研究设计为探索性研究，未进行正式的预先样本量计算。

**样本特征**：13例BEB患者纳入研究，包括6例男性和7例女性，平均年龄73.8 ± 10.7岁。所有患者均接受慢性BoNT-A治疗，平均治疗持续时间9.8 ± 6.6年（范围：2–19年）。按照Tolosa和Martí分类，临床表型分为3种主要亚型：阵挛型（n = 7）、肌张力障碍型（n = 4）和强直型（n = 2）。5例患者（38.5%）合并眼睑睁开失用（eyelid opening apraxia, EOA），其中阵挛型2例、肌张力障碍型2例、强直型1例。

**神经生理学发现**：神经生理学结局分别对右眼、左眼及双眼联合进行分析，单眼分析为主要神经生理学结局，联合分析作为补充分析以利用其更大的统计学效能。BoNT-A治疗后，所有ISI和两侧的非条件化及条件化R2波幅均观察到统计学显著降低（所有p < 0.05），与毒素已知的外周神经肌肉效应一致。值得注意的是，R2波幅比值在单独分析每只眼时，于200、300和500 ms ISI处治疗后出现统计学显著降低，1000 ms ISI处仅左眼达到统计学显著性（p = 0.010），而右眼未达（p = 0.052）。当双眼联合考虑时，所有ISI处波幅比值降低均具有统计学显著性（所有p Amazon ≤ 0.001），为治疗后脑干中间神经元兴奋性降低提供了更强证据。重复测量ANOVA确认，双眼联合考虑时（F_1,50 = 58.997, p < 0.001, η² = 0.225）、仅右眼（F_1,24 = 26.293, p < 0.001, η² = 0.210）和仅左眼（F_1,24 = 32.077, p < 0.001, η² = 0.243）时，治疗对R2比值均有统计学显著效应。两个时点均确认波幅比值随ISI增加而统计学显著增加（F_{2.766,138.320} = 59.886, p < 0.001, η² = 0.310），且T1曲线在所有ISI处均一致低于T0曲线，反映治疗后脑干中间神经元兴奋性的一致降低。然而，Bonferroni校正后，右眼1000 ms ISI（p = 0.052）和左眼500 ms ISI（p = 0.061）的统计学显著性丧失，表明BoNT-A的中枢调控效应在较短刺激间期表达最为一致。

**临床结局**：所有患者BoNT-A治疗后均显示临床改善。与T0相比，T1时所有三种临床量表均观察到统计学显著降低：BSPSS从7.6 ± 1.9降至5.4 ± 1.7（p < 0.001），JRS从5.9 ± 1.3降至3.4 ± 1.3（p < 0.001），BDS从12.1 ± 5.8降至6.5 ± 4.9（p < 0.001）。

**亚组分析**：所有亚 sensitive 亚组分析均为探索性，鉴于样本量小和 inherent 的I型及II型错误风险，应谨慎解读。各临床亚型（阵挛型、肌张力障碍型和强直型）间R2波幅比值无论是在基线（F_2,23 = 0.724, p = 0.496, η² = 0.023）还是治疗后1个月（F_2,23 = 0.686, p = 0.514, η² = 0.008）均无统计学显著差异，提示脑干兴奋性无论临床表型如何均被BoNT-A类似调控。然而，强直亚型JRS评分降低显著小于阵挛型（1.0 ± 1.2 vs. 2.7 ± 0.7, p = 0.018）和肌张力障碍型（1.0 ± 1.2 vs. 3.0 ± 1.3, p = 0.010）（F_2,10.389 = 4.536, p = 0.038, η² = 0.337）。鉴于强直亚组样本量极小（n = 2），该发现应谨慎解读。各亚型间BSPSS（F_2,14.171 = 1.997, p = 0.172, η² = 0.148）或BDS（F_2,10.484 = 1.006, p = 0.398, η² = 0.085）降低幅度无统计学显著差异。

合并EOA患者（n = 5）与无EOA患者相比，R2波幅比值无论是在基线（F_1,24 = 0.344, p = 0.563, η² = 0.005）还是治疗后（F_1,24 = 1.969, p = 0.173, η² = 0.009）均无统计学显著差异。同样，EOA与非EOA患者间临床量表降低幅度无统计学显著差异（BSPSS：F_2,13.389 = 0.006, p = 0.939；JRS：F_2,14.767 = 1.172, p = 0.296；BDS：F_2,15.741 = 0.020, p = 0.980）。

**讨论**：本研究的主要发现是，BoNT-A治疗似乎可降低BEB患者的脑干中间神经元兴奋性，证据为瞬目反射恢复周期R2波幅比值的降低，尤其在较短刺激间期更为突出。关键的是，这种波幅比值的降低独立于毒素预期的外周神经肌肉效应而被观察到，支持BoNT-A存在直接中枢调控作用。瞬目反射恢复周期是评估三叉神经-面神经脑干环路内抑制性处理的成熟指标。BEB患者中，短ISI时第二个R2反应的抑制减弱反映了中间神经元兴奋性增高和抑制性控制受损——这是该病症确立的神经生理学特征。BoNT-A治疗后R2波幅比值的降低提示脑干中间神经元兴奋性出现 substantial 但非完全的降低。T0时，本队列R2波幅比值显著高于健康受试者报告值，提示基线时脑干过度兴奋，但因缺乏采用相同方案记录的内部对照组，无法直接比较。治疗后T1值显示 significant 降低，但仍高于已发表的正常值，尤其在较短ISI时。这种改善模式与临床量表观察到的有意义但不完全的改善一致。

条件化和非条件化R2波幅的降低与BoNT-A已确立的外周作用机制一致——通过SNAP-25裂解抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱释放。然而，同时发生的R2波幅比值的统计学显著降低（其可校正外周神经肌肉效应）为超越神经肌肉接头的中枢调控作用提供了初步证据。动物模型中已证明的合理机制为：BoNT-A经轴突逆向运输至运动神经元胞体，随后跨突触扩散至二级神经元，导致中枢突触末梢SNAP-25裂解——尽管人类直接证据仍然缺乏。这将导致脑干中间神经元环路内神经递质释放减少，从而降低三叉神经-面部通路兴奋性，与本研究观察到的R2波幅比值降低一致。

此前研究对BoNT-A于瞬目反射恢复周期效应的报告存在冲突。本研究发现与Valls-Solé等和Grandas等报告无统计学显著变化的差异可归因于若干方法学差异。首先，既往研究均在注射后约3周评估患者，而本研究在1个月时评估——这一时间框架与BoNT-A外周和中枢神经调控效应的时间进程更为一致。实验研究已证明，外周BoNT-A注射后中枢SNAP-25裂解在数周内进行性增加。此外，神经肌肉接头处最大外周效应据报道出现在注射后约4周，提示1个月时可能更好地反映BoNT-A外周和中枢效应的充分表达，可能比既往研究使用的3周评估更为适当。其次，Grandas等采用单侧注射并仅从未治疗侧记录，引入了与侧别不对称性相关的潜在混杂因素。第三，或许最关键的是，既往研究主要依赖绝对R2波幅，其受BoNT-A外周神经肌肉效应 substantial 影响。相比之下，本研究作为主要结局使用的R2波幅比值可校正外周化学去神经支配，提供脑干中间神经元兴奋性的更特异指标。因此，本队列观察到的R2波幅比值的统计学显著降低支持独立于外周肌无力的直接中枢调控效应。

单独分析每侧时，R2波幅比值降低在较短ISI（200–500 ms）时最为稳健，1000 ms ISI时在Bonferroni校正后统计学显著性欠一致。这种模式可能反映两个并存因素：首先，较长ISI时健康受试者R2抑制程度也生理性降低，导致个体间变异增大、检测治疗相关变化的敏感性降低；其次，T0与T1间R2波幅比值差异在较长ISI时较小，需要更大样本量以达到统计学显著性。双眼联合分析时，治疗效应在所有ISI处均具有统计学显著性，与单眼分析一致，进一步提供BoNT-A治疗后脑干中间神经元兴奋性治疗相关降低的汇聚证据。各临床亚型间及合并与不合并EOA患者间R2波幅比值无统计学显著差异，提示BoNT-A对脑干中间神经元兴奋性的调控效应不受临床表型或失用症存在与否的影响。这一发现可能表明BoNT-A的中枢神经调控机制作用于所有BEB表型共有的三叉神经-面部环路内，无论临床表现如何。强直亚型JRS评分降低显著小于阵挛型和肌张力障碍型。这是否反映各亚型间BoNT-A临床反应性的真实差异，抑或JRS在捕捉强直型改善方面的局限性，尚不明确，需在更大队列中研究。本探索性研究的亚组分析 inherently 为探索性，无法从现有数据得出亚组特异性结论。

EOA患者中神经生理学差异的缺乏值得注意，因为EOA被认为涉及不同的病理生理机制，包括核上性或皮质功能障碍导致的自愿性眼睑睁开受损。EOA亚组中缺乏 distinct 神经生理学特征可能提示，瞬目反射恢复周期测量的脑干内神经元兴奋性并未特异性捕捉EOA的 underlying 机制——或者EOA并未在BEB已存在的脑干过度兴奋基础上带来额外的脑干过度兴奋。

本队列中，R2波幅比值降低幅度与任一评量表临床改善程度间未观察到统计学显著相关性。这一发现可能反映样本量小和由此导致的检测中度相关性的统计学效能受限，而非神经生理学结局与临床 outcomes 间真实缺乏关联。未来更大规模队列研究应专门调查这种关联，因为强有力的相关性将为中枢神经调控与BEB中BoNT-A治疗疗效的直接关联提供证据，并可能作为治疗反应的神经生理学生物标志物。

本研究存在若干局限性。样本量小（n = 13）降低了统计学效能并限制结果可推广性，尤其亚组分析——强直亚组（n = 2）太小而无法得出有意义的表型特异性结论，需要更大规模多中心研究来证实和扩展这些结果。鉴于探索性研究设计，未进行正式的预先样本量计算；然而，主要神经生理学结局的观察效应量对于右眼（η² = 0.210, F_1,24 = 26.293）和左眼（η² = 0.243, F_1,24 = 32.077）分析均为大效应，超过传统大效应阈值（η² > 0.14），提示研究在观察样本量下对检测主要治疗效应具有足够敏感性。这些值与在相似或更小样本量进行的BEB脑干兴奋性类似神经生理学研究观察到的效应量相当，支持探索性设计对主要结局检测的统计学 adequate 性。双侧分析（n = 26）未正式考虑双眼间的被试内相关性，因每只眼被作为独立观察处理；这代表统计学局限性，单眼分析（n = 13）应被视为主要神经生理学结局。此外，R2波幅比值可能无法完全校正外周神经肌肉效应，因为BoNT-A可能潜在改变外周肌电图反应的形态，包括时间离散度和肌纤维激活同步化。缺乏健康对照组和未治疗BEB对照组限制了对观察到的神经生理学变化的解读，因为无法排除脑干兴奋性随时间的自发波动对观察到的R2波幅比值降低的贡献；此外，缺乏采用相同方案获取的内部标准数据组排除了关于脑干兴奋性正常化的 definitive 结论，因此观察到的变化应被解读为瞬目反射恢复参数的治疗相关性降低。仅评估了单一治疗后时间点，BoNT-A中枢调控效应的发生、峰值和持续时间未获表征，需要在多个时间点进行纵向评估以充分阐明其时程。所有患者入组前已处于慢性BoNT-A治疗状态，重复注射的潜在累积性神经调控效应无法量化，遗留观察到的变化反映急性还是长期治疗效应的问题悬而未决。最后，单中心设计和标准化注射方案可能进一步限制这些发现向使用不同毒素制剂、剂量或技术的场景的推广性。

**结论**：本项探索性研究提供了初步证据，表明BoNT-A治疗可能降低BEB患者的脑干中间神经元兴奋性，证据为瞬目反射恢复周期R2波幅比值出现 substantial 且一致的降低。伴随的临床结局改善支持以下假说：BoNT-A在BEB中的治疗效能不仅依赖于外周化学去神经支配，还涉及对脑干抑制性环路的中枢神经调控——这一机制与动物模型中已证明的毒素轴突逆向运输和跨突触扩散一致。这些发现有助于更好地理解肉毒毒素的作用机制和BEB的病理生理学。未来需要更大规模队列、健康对照组、多个随访时间点以及神经生理学与临床结局间直接相关性分析的研究来证实和扩展这些结果。