《Stress》：Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation and stress regulation: preclinical insights and unresolved challenges
慢性应激暴露是多种精神与躯体疾病发生和维持的重要危险因素。非侵入性迷走神经通路调控因其在脑-体通讯中的核心作用，日益受到关注，成为预防与治疗应激相关疾病的潜在策略。通过刺激耳部迷走神经传入纤维，经皮耳迷走神经刺激（taVNS）被认为可激活应激调节回路，进而产生调控应激相关生理的下游效应。与此机制推理一致，临床前啮齿类研究已开始探索taVNS作为非侵入性手段减轻应激相关结局的有效性。本综述旨在总结这一新兴临床前证据，重点关注涉及应激调节的中枢神经回路、下游自主神经功能、炎症信号通路及肠道微生物群组成等潜在机制。总体而言，现有研究支持taVNS作为应激反应多系统调控器，通过相互关联的神经、自主神经、免疫及肠-脑通路发挥作用。然而，临床前taVNS研究尚处于早期阶段。主要未决挑战包括缺乏标准化刺激参数，以及未充分考虑生物学性别作为关键实验变量的重要性。解决这些局限对于提高研究可重复性及加强转化相关性至关重要。
**2. 经皮迷走神经刺激：拓展应激相关疾病治疗途径**
迷走神经电刺激最初通过侵入性方式实施，需植入脉冲发生器并将电极缠绕于颈部迷走神经周围。尽管有效，侵入性迷走神经刺激（VNS）伴随显著风险，如术中电极测试时意外刺激心脏迷走神经分支可导致心动过缓或心脏停搏，以及术后感染、疼痛和手术部位血肿等并发症。尽管存在这些局限，侵入性VNS在难治性癫痫中显示疗效，并于1997年获FDA批准。此后，研究人员观察到接受VNS治疗的癫痫患者出现情绪与幸福感改善，进而推动其抗抑郁效应的深入研究，最终促成VNS于2005年获FDA批准用于治疗抵抗性抑郁症。
近年来，经皮耳迷走神经刺激（taVNS）作为一种更安全、侵入性更小的替代方案应运而生，通过刺激外耳迷走神经耳支（ABVN）调控迷走神经通路，克服了侵入性VNS的部分局限。一项涵盖167篇人体taVNS应用研究的荟萃分析表明，taVNS技术安全，不良事件发生风险未增加。ABVN支配外耳道及耳甲腔区域，其中耳甲艇（cymba conchae）仅由迷走神经纤维支配。ABVN刺激已被证实可直接调节孤束核（NTS）活动，潜在影响包括杏仁核和伏隔核在内的皮层-边缘-丘脑神经回路，这些脑区在应激反应调节及应激相关精神病理（包括抑郁）的发生发展中发挥关键作用。因此，相较于其他非侵入性神经调控方法（如经颅磁刺激、经颅直流电刺激），taVNS具有直接靶向参与脑-体通讯和应激调节的迷走神经通路的优势。
在人体中，越来越多证据表明taVNS具有调节应激反应的潜力。taVNS可减少急性心理应激暴露健康志愿者及慢性应激受试者的感知应激水平，降低皮质醇水平，减少交感神经传出，并降低脑电图记录中的θ波段路径长度，提示增强的全网络效率可能有助于防止应激升级。在啮齿类模型中，taVNS同样显示出减轻应激相关结局的非侵入性策略价值。现有新兴研究表明，taVNS可缓解慢性不可预测轻度应激（CUMS）、睡眠剥夺、轻度单次延长应激或束缚应激等不同应激范式下的抑郁样及焦虑样行为。例如，慢性taVNS（28天）可增加CUMS雄性大鼠的蔗糖偏好并减少强迫游泳测试中的不动时间，且该效应仅见于20 Hz刺激频率，5 Hz或100 Hz则无效。后续研究采用相同慢性应激方案报告了15 Hz或交替2/15 Hz频率下的类似抗抑郁样效应。此外，taVNS还可减轻慢性社会挫败应激小鼠的应激诱导社交回避行为。
**3. taVNS在应激相关疾病中有效性的潜在机制**
taVNS在慢性应激条件下有益效应的机制尚不完全清楚。动物研究为利用侵入性电生理、神经化学和神经解剖学方法探究taVNS激活的神经回路和外周通路提供了独特机会，这些方法在人体中难以实施。此外，临床前模型允许在高度控制条件下系统操纵刺激参数（包括刺激侧别、频率和持续时间），从而深入理解taVNS对应激相关过程的效应机制。本节概述taVNS可能对抗应激诱导改变的中枢和外周机制，基于啮齿类模型获得的多方面证据。
**3.1. 中枢神经通路**
taVNS发挥有益效应的关键机制之一是重塑调节应激反应的中枢神经回路。慢性应激破坏关键皮层-边缘通路，导致适应性情绪加工受损和精神病理易感性增加。越来越多证据表明，taVNS调节整合自主神经、情绪和认知应激反应脑区内的神经化学信号传递。例如，taVNS激活NTS——一个主要的自主神经整合中枢，其投射至下丘脑及包括网状结构和副交感神经节前神经元在内的多个脑干区域。另一个与NTS直接相连、参与应激反应调节的关键脑干区域是蓝斑核（LC），其为脑内儿茶酚胺（尤其是去甲肾上腺素，NE）的主要来源。LC-NE系统的改变在多种应激相关障碍中均有报道，包括焦虑中NE信号增加、抑郁和创伤后应激障碍（PTSD）中NE产生减少。尽管LC-NE系统被认为发挥应激反应的唤醒和认知测量功能，新近证据提示其也导致社会应激诱导心血管功能障碍的个体差异。
值得特别关注的是，人体研究表明taVNS可调节LC活动，代表这种非侵入性干预调节应激反应、促进更适应性应对策略的潜在中枢机制。然而，人体研究中仅可获得LC-NE功能的间接测量指标，包括功能磁共振成像（fMRI）、瞳孔测量、胃频率、事件相关电位（P300）和NE代谢物。因此，动物研究对于深入理解taVNS如何直接影响LC-NE系统至关重要。近期一项研究在自身免疫病小鼠模型中证实，taVNS激活LC的去甲肾上腺素能神经元，采用免疫荧光染色结合在体电生理记录方法；有趣的是，尽管仅对左耳施加taVNS，却观察到左右两侧LC均被激活。此外，急性和重复（超过3天）taVNS均增加LC神经元活动，表明对重复刺激无显著习惯性适应。taVNS还改善该动物模型中标准测试（强迫游泳测试、溅水测试和新奇物体识别测试）的行为反应。研究人员进一步证明，化学遗传学激活LC去甲肾上腺素能神经元具有类似行为效应，如溅水测试中修饰行为增加。这些发现支持LC在促进更适应性应激应对行为中的机制性作用，可能通过影响中缝背核的5-羟色胺系统实现。
迄今为止，taVNS对LC功能的具体效应尚未在应激范式暴露的啮齿类中加以研究。相反，啮齿类研究聚焦于更高阶的边缘和皮层结构，这些结构常参与应激相关障碍的病理生理学，包括前额叶皮层（PFC）、杏仁核、前扣带皮层（ACC）、腹被盖区（VTA）多巴胺能神经元和海马。这些少量啮齿类研究表明，taVNS影响这些关键应激反应性脑回路，指向该干预应激韧性效应的中枢通路。例如，taVNS已被证明改变CUMS暴露青春期大鼠海马、ACC和内侧PFC的转录组学和/或蛋白质组学特征，而另一项研究提示taVNS可能也通过转录后修饰发挥作用以缓减应激诱导的海马改变。
随着探索taVNS在应激啮齿类中潜在机制的研究持续增多，越来越明确的是该技术可能涉及多种中枢机制，延伸至分子调控之外的直接调制关键脑区神经元活动。近期研究报道，在不同应激方案暴露的雄性小鼠中，taVNS增强VTA多巴胺能神经元活动或ACC神经元活动。综合而言，初步但趋同的证据表明，taVNS可能通过分子、转录后和神经元水平直接调节应激反应性脑回路，促进应激韧性。
**3.2. 心脏自主神经通路**
慢性应激破坏自主神经平衡，导致副交感神经（迷走神经）调节减弱背景下交感神经系统的延长和/或夸大激活。这种失衡促进多种常共病的应激相关病理发生。因此，taVNS被提出作为恢复自主神经平衡、改善应激诱导症状的治疗策略。
心率变异性（HRV）被广泛认可为心脏自主神经调节的替代指标，因为交感神经和副交感神经对窦房结起搏器活动的动态交互产生健康心脏节律的特征性复杂变异性。静息条件下，自主神经系统（ANS）两个分支均紧张性调节心脏功能，以迷走神经调节为主导；而这种平衡在应激下明显受损。静息HRV的慢性降低与广泛的应激相关障碍相关，包括抑郁、焦虑障碍以及心血管和胃肠道疾病。一致地，慢性暴露于应激范式的啮齿类表现出HRV降低，常与应激暴露的有害行为、生理、神经内分泌后果的易感性增加相关。较高的静息迷走神经介导的HRV（vmHRV）与更好的健康结局广泛相关，使其成为有前景的应激韧性生物标志物。
从机制角度，ABVN刺激被认为增加传入NTS的输入，影响投射至背侧迷走神经核和疑核心脏抑制性迷走神经传出神经元的神经元，其纤维支配窦房结；该通路将增强迷走神经传出（副交感神经）活动。同时，ABVN刺激可能激活NTS神经元向延髓尾端腹外侧部发送兴奋性投射，从而抑制延髓头端腹外侧部——脊髓交感神经节前神经元兴奋性驱动的主要来源。这种抑制将降低交感神经活动。通过这些互补途径，taVNS可能同时增强心脏副交感神经调节和减少交感神经影响，从而提高HRV。然而，人体研究中taVNS对vmHRV的效应结果不一，这种异质性部分可能源于人体研究中刺激方案缺乏一致性，这在啮齿类中也有体现。例如，单次taVNS仅在特定频率下短暂增加两性年轻成年大鼠的vmHRV；Choi等报道两次taVNS增加药理学诱导癫痫雄性大鼠的vmHRV，且HRV效应在第二次5分钟刺激期间更为明显，提示重复刺激的潜在累积效应。初步动物模型证据表明taVNS具有增加vmHRV的潜力，对应激相关障碍的预防和/或治疗具有意义。
**3.3. 抗炎通路**
应激暴露被一致证明在外周和脑内诱导促炎反应。应激相关炎症日益被认为是抑郁和其他应激相关精神病理（如PTSD）病理生理学的关键促成因素。众多研究报告了多种应激范式暴露动物以及PTSD患者、重性抑郁障碍患者循环和中枢促炎细胞因子（主要为IL-6、TNF-α和IL-1β）水平升高。啮齿类研究强烈提示炎症在焦虑和抑郁样症状建立中的因果作用。
迷走神经通过激活炎症反射发挥免疫调节作用，这是一种中枢整合的生理性机制，限制过度的促炎细胞因子产生。该反射的关键组成部分是胆碱能抗炎通路（CAP）。促炎介质如TNF-α、IL-1β和前列腺素激活迷走感觉神经元，进而激活反射的迷走神经传出臂。该传出信号通过巨噬细胞和其他免疫细胞表达的α7-烟碱受体介导；这些胆碱能受体的激活抑制促炎细胞因子的合成。与纯体液抗炎机制（如糖皮质激素信号）相比，CAP快速运作，可在早期阶段限制炎症。在应激背景下，这种"闪电般快速"的调节可能特别有利于限制应激诱导炎症的负面后果，降低应激相关精神病理的易感性。
自炎症反射发现以来，迷走神经电刺激已被广泛研究其抗炎特性，大量证据支持其在多种炎症条件下的有效性。例如，重复taVNS显著降低蛛网膜下腔出血患者血浆和脑脊液TNF-α和IL-6水平，效应在治疗启动两周内即显现。类似地，taVNS减少急性缺血性卒中患者、COVID-19住院患者的循环促炎标志物；后者研究中，taVNS后炎症标志物降低伴随医院焦虑抑郁量表评分降低。临床前研究也日益调查taVNS介导的炎症反射激活，证实其在从结肠炎到急性痛风等不同病理模型中的抗炎功效。
在应激啮齿类模型中考察taVNS的多项研究聚焦其抗炎效应。这些研究中，taVNS降低应激敏感脑区（包括海马和下丘脑）的促炎细胞因子表达，以及小胶质细胞水平的促炎效应。外周也观察到抗炎效应，包括缓减应激诱导的心脏和循环细胞因子水平增加。机制上，taVNS被认为激活关键脑区的α7-烟碱受体，促进抗炎信号级联（如JAK2/STAT3），同时抑制NF-κB介导的促炎通路。这些分子效应常伴随应激诱导行为改变的改善，支持taVNS抗焦虑和抗抑郁样效应至少部分由其免疫调节作用介导的假设。
**3.4. 微生物-肠-脑通路**
慢性应激与肠道微生物群改变反复相关，肠道微生物群是定居于胃肠道的复杂微生物群落，贡献于肠道生理并对宿主健康产生广泛影响。微生物群失调也被认为参与多种应激相关精神病理（包括抑郁）的病理生理学。肠微生物群与脑之间的密切关系由多种双向通讯通路支持，统称为微生物-肠-脑轴。肠道微生物群与脑通过神经解剖通路（最显著为迷走神经）、神经内分泌系统（如下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴）以及细胞因子介导的免疫信号相互作用。此外，微生物来源的代谢物（如短链脂肪酸）以及微生物来源的神经递质提供直接和间接的额外通讯途径。
迷走神经已成为该轴中最直接的调节途径之一，啮齿类迷走神经切断术研究证实了其在介导肠-脑通讯中的因果作用。例如，慢性摄入鼠李糖乳杆菌的积极行为和神经化学效应被膈下迷走神经切断术消除，表明迷走神经信号是微生物群驱动情绪行为调节所必需的。Chang等最近的研究为连接脑活动与肠道微生物调节的特定迷走神经传出机制提供了有力证据：中央杏仁核神经元通过迷走神经传出信号刺激十二指肠Brunner腺黏液产生，从而促进肠道乳酸杆菌属的增殖；慢性应激被证明抑制中央杏仁核活动，导致Brunner腺功能降低和乳酸杆菌群落定植受损，进而引起肠道屏障完整性受损和感染易感性增加。
基于上述证据，taVNS可能通过影响肠生理和微生物组成的中枢网络发挥作用。一致地，taVNS已被证明显著改变CUMS暴露雄性大鼠的肠道微生物群组成，其微生物群特征更接近非应激动物，提示taVNS可能部分恢复肠道微生物群落向"非应激"状态。重要的是，taVNS促进有益细菌相对丰度增加，包括乳酸杆菌属成员及相关种如嗜黏蛋白阿克曼菌。这种黏液降解细菌以宿主来源的黏液为生，将其转化为支持上皮完整性、强化肠道屏障功能和促进宿主代谢健康的短链脂肪酸。上述迷走神经介导的杏仁核-Brunner腺通路提示，taVNS可能促进慢性应激抑制的黏液产生，从而为包括嗜黏蛋白阿克曼菌在内的健康促进细菌增殖创造有利的肠道环境。
taVNS调节肠道微生物群的能力也在应激背景外的胃肠道疾病中得到报道，尽管这些疾病仍与应激相关症状密切相关。例如，taVNS改善便秘型肠易激综合征（IBS-C）小鼠模型的便秘相关症状，包括粪便颗粒数、粪便重量和粪便含水量，并增强肠道蠕动性；该研究中taVNS治疗的IBS-C小鼠显示与假治疗动物不同的肠道微生物特征，以乳酸杆菌属和双歧杆菌属相对丰度增加为特征，这两属被广泛视为益生菌类群。IBS-C患者的单中心、单盲、随机对照试验也报告了类似发现。这些发现共同突出taVNS通过作用于微生物-肠-脑轴促进应激韧性的潜力。然而，该领域研究仍处于早期阶段，关于taVNS诱导的肠道微生物群变化的特异性、方向性和长期稳定性，以及其对传入与传出迷走神经通路的依赖性等关键问题仍有待解答。
**4. taVNS应激研究中的未决挑战**
随着taVNS作为应激反应潜在调节器受到关注，关键挑战依然存在，最显著的是最优刺激参数的确定以及两性别的系统纳入。在临床前研究中解决这些问题对于指导合理且可转化的taVNS方案至关重要。
**4.1. taVNS方案缺乏标准化**
尽管近期多项研究报告了taVNS在啮齿类应激模型中的有益效应，这些工作在刺激参数方面存在显著异质性。这些研究主要关注taVNS的治疗效力，而非系统评估不同刺激参数对结局指标的影响。因此，taVNS报告效应是否具有参数特异性仍不清楚。迄今为止，仅有限研究直接比较不同刺激参数的效应。例如，Li等考察了taVNS在三种刺激频率（5 Hz、20 Hz和100 Hz）下的抗抑郁样效应，证明仅20 Hz刺激逆转抑郁样行为并使HPA轴活动正常化；20 Hz taVNS在其他临床前应激模型中也显示出 robust 的神经调节效应，在NTS和尾端脊髓三叉神经核等关键脑干核团中诱发最高比例的 responsive 神经元，这可能部分解释其行为效力。然而，其他频率的taVNS也报告了积极行为 outcome。与之相对，其他生理 outcome 似乎对 adopted 刺激方案更为敏感。例如，HRV参数似乎特别依赖刺激频率：研究人员最近证明，健康成年雄性大鼠对急性taVNS存在差异频率特异性反应，心率显著降低和vmHRV增加主要见于6 Hz而非20 Hz。
除刺激参数外，麻醉的使用是进一步增加临床前taVNS研究变异性的主要方法学混杂因素。麻醉剂可深刻影响自主神经功能、迷走神经张力和中枢神经活动，从而与taVNS靶向的生理通路发生交互作用。此外，重复全身麻醉暴露可能独立影响应激相关和心血管结局，使taVNS效应的解释复杂化。近年来，已有努力在清醒和自由活动的啮齿类中实施taVNS，该方法可能减少变异性并提高临床前发现的解释性和转化相关性。然而，解释清醒动物taVNS研究结果时仍需谨慎，特别是应激研究背景下：即使经过适应，身体束缚本身可能构成应激源并诱导应激反应，可能混淆行为、自主神经和神经内分泌 outcome，需要仔细控制和考量。
**4.2. 左耳还是右耳？这是个问题**
十余年前，多位作者开始质疑优先选择左侧而非右侧VNS是出于安全考虑还是更多基于传统观念而非科学证据。历史上，由于迷走神经心脏支配的不对称性——右侧迷走神经主要支配窦房结，而左侧迷走纤维主要投射至房室结——右侧颈部VNS被认为风险更高。因此，左侧颈部VNS始终是标准选择以避免右侧颈部VNS的不良心脏效应（如显著心动过缓）。类似地，常规使用左侧刺激的特征也延续至taVNS研究。
然而，有观点认为在ABVN刺激背景下，偏侧化问题可能不相关：这些传入信号可能在NTS内被中枢整合，之后传出迷走神经输出双侧离开中枢神经系统；因此，这种中枢整合将缓和右侧与左侧taVNS效应的差异。但这一观点受到人体和啮齿类发现的挑战，后者表明右侧taVNS后vmHRV增加更大。而且，趋同证据表明右侧taVNS没有心脏副作用。尽管如此，考察taVNS在应激啮齿类中效力的研究很少报告刺激偏侧化；当明确说明时，方案最常涉及双侧刺激或仅为左侧耳刺激。taVNS研究中刺激偏侧化的不充分论证和报告，特别是当基于侵入性颈部VNS研究的传统时，可能代表一个被低估的方法学局限，并导致人体vmHRV报告效应的变异性。这一偏倚对韧性研究有直接含义：增强的迷走神经张力和vmHRV与适应性应激反应和情绪改善更近改善密切相关。通过系统偏好评左侧刺激，当前taVNS方案可能未能最优招募参与应激缓冲的迷走神经传入通路，从而低估taVNS促进应激韧性的能力。
**4.3. 以雄性为中心的临床前框架：为什么排除雌性不再可行**
至此，读者可能已注意到本综述讨论的所有研究均在雄性动物中进行。当明确说明时，排除雌性啮齿类的主要依据是 presumed 发情周期相关激素波动对迷走神经活动的混杂影响。的确，发情周期相位已被证明调节传入迷走神经活动，包括NTS内的神经递质释放。卵巢激素，特别是雌激素，已知通过基因组（如核受体介导）和非基因组（如核外受体介导）机制影响中枢自主神经网络。实验证据进一步表明，雌激素增强中枢神经系统以及心血管系统中胆碱能毒蕈碱受体的活性和/或密度，提示卵巢激素可能有意义地塑造生理对taVNS的反应。
与这些机制观察一致，发情周期依赖性迷走神经活动调节已在人体和啮齿类中通过HRV测量得到记录。在健康女性中，vmHRV与排卵时循环17β-雌二醇水平呈显著正相关；一项荟萃分析证明月经周期黄体期vmHRV显著降低。大鼠中也观察到类似的周期相关变异，发情期（对应于人类排卵）vmHRV较其他周期相位显著增加。雌性性激素对迷走神经活动的强烈影响可能至少部分解释了人体和啮齿类中 well-documented 的静息vmHRV性别差异：女性和雌性啮齿类始终表现出较雄性对照更高的静息vmHRV。这一基础自主神经差异在考虑taVNS的性别特异性心血管和自主神经反应时高度相关，凸显了将基础taVNS研究扩展至雄性中心模型之外的必要性。
重要的是，新兴证据表明雌性啮齿类对taVNS的反应可能与雄性不同。例如，研究人员先前已证明性别依赖性HRV对相同刺激参数的反应：6 Hz taVNS时雄性较雌性表现出更大的心率和HRV反应，而20 Hz刺激时出现相反模式。这些发现表明taVNS反应存在性别依赖性差异，可能反映基线自主神经张力和激素敏感性神经回路的差异。综合这些观察，从临床前taVNS研究中排除雌性动物在科学上已不再具有合理性。虽然发情周期中激素波动不可否认地影响迷走神经张力，但这种变异性代表生物学上有意义的信号而非实验混杂。忽略一半人群不仅限制现有发现的普遍性，还可能主动遮蔽taVNS发挥效应的性别特异性机制。因此，仅基于雄性研究的结论（特别是关于taVNS对抗应激暴露负面后果的能力）不能假定可推广至雌性，尤其考虑到 well-established 的应激易感性性别差异。向性别包容性临床前框架转变因此至关重要，这不仅是为了提高转化效度，也是为了推进对taVNS作用在生物学背景下更机制性和 nuanced 的理解。
