Emx1谱系中Sox5失活的小鼠作为人类Lamb-Shaffer神经发育综合征的模型

《Brain Research》：Mice with Sox5 inactivation in the Emx1 lineage as a model for the human Lamb-Shaffer neurodevelopmental syndrome

　　

Lamb-Shaffer综合征（LAMSHF）是一种由失活一个SOX5等位基因的变异引起的神经发育障碍，因此揭示了人类SOX5在高级脑功能中的单倍剂量不足。SOX5编码一种SRY相关转录因子，在皮质深层兴奋性神经元中高表达。先前研究表明，Sox5^-/-小鼠在出生时死亡，并伴有这些细胞的分化严重受损，而Sox5^+/-小鼠在生命周期中外观正常，但未对其神经缺陷进行研究。研究人员在此探究了这些小鼠以及通过Emx1^Cre介导的Sox5在皮质和海马兴奋性神经元及胶质细胞祖细胞中失活的小鼠是否表现出LAMSHF样行为。新皮质神经元的缺陷在Sox5^-/-和Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠中同样严重，而在Sox5^+/-和Sox5^fl/+Emx1^Cre/+小鼠中则轻微。Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠存活至出生，但除非提供营养凝胶补充剂，否则在断奶期前后难以存活。行为测试揭示了Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠的运动功能缺陷、焦虑减轻、学习和记忆能力受损以及自闭症样行为，而Sox5^+/-和Sox5^fl/+Emx1^Cre/+小鼠仅有微小改变。脑电图结果与纯合突变体中皮质组织轻度、弥漫性改变一致。因此，尽管Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠的异常特征提示LAMSHF，但全球性和条件性杂合突变体表现出轻微或无缺陷。研究人员得出结论，小鼠Sox5在促进高级功能实现方面可能不如人类SOX5那样存在单倍剂量不足，并且在Emx1谱系中Sox5纯合缺失的小鼠是进一步研究SOX5的LAMSHF相关功能以及临床前测试LAMSHF患者候选治疗方案的合适模型。

论文解读：Emx1谱系中Sox5失活小鼠作为人类Lamb-Shaffer神经发育综合征的模型

**研究背景与问题**

Lamb-Shaffer综合征（LAMSHF）是一种由SOX5基因单倍剂量不足引起的神经发育障碍，其特征包括早期全面发育迟缓、运动协调困难、显著的语言障碍以及终身轻至中度智力残疾。多数患者还表现出社交行为差异，属于自闭症谱系障碍（ASD）范畴。尽管物理和职业治疗有助于改善患者状况，但由于对SOX5基因表达、蛋白活性及其在脑发育过程中的分子网络了解有限，目前仍缺乏有效的药物或基因治疗。此前研究发现，Sox5全基因敲除小鼠（Sox5^-/-）在出生时死亡，且其深层皮质兴奋性神经元分化严重受损；而Sox5杂合小鼠（Sox5^+/-）虽外观正常，但未进行神经功能和行为学评估。因此，尚不清楚出生后Sox5杂合或纯合缺失的小鼠是否表现出LAMSHF样行为。

**研究目的**

鉴于上述空白，本研究旨在通过行为学和脑电图（EEG）分析，评估全球性Sox5杂合失活小鼠以及通过Emx1^Cre介导在皮质和海马兴奋性神经元及胶质细胞祖细胞中Sox5杂合或纯合失活的小鼠是否表现出LAMSHF样表型，从而验证这些小鼠作为LAMSHF模型的可行性。

**主要结论与意义**

研究发现，Sox5在Emx1谱系中纯合缺失的小鼠（Sox5^fl/flEmx1^Cre/+）存活至出生，但断奶期前后出现生长停滞，需营养凝胶补充剂方能存活。成年后，这些纯合突变小鼠表现出运动功能缺陷、焦虑减轻、学习和记忆能力受损、自闭症样行为（如对物体而非社交刺激的偏好）以及重复行为异常（如筑巢能力受损）。脑电图显示皮质网络组织轻度、弥漫性改变。相比之下，无论是全球性还是条件性Sox5杂合失活的小鼠（Sox5^+/-和Sox5^fl/+Emx1^Cre/+），在大多数行为测试中与野生型小鼠无显著差异，仅表现出轻微的表型。这些结果表明，小鼠Sox5在脑功能中的单倍剂量不足程度可能低于人类SOX5，而Emx1谱系中Sox5纯合缺失的小鼠更能有效模拟LAMSHF的关键特征。因此，该模型不仅适用于深入研究SOX5在脑中的细胞和分子功能，也为临床前测试LAMSHF候选治疗方案提供了重要平台。该论文发表于《Brain Research》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：1）基因工程小鼠模型构建：利用Sox5条件性无效等位基因（Sox5^fl）和Emx1^Cre敲入等位基因（小鼠品系来源自Jackson Laboratories），通过交配策略产生全球性杂合（Sox5^+/-）和条件性杂合/纯合（Sox5^fl/+Emx1^Cre/+、Sox5^fl/flEmx1^Cre/+）突变小鼠，所有小鼠均维持在高纯度C57BL/6J遗传背景中。2）脑组织分析：通过免疫荧光染色（使用SOX5抗体）和RNA原位杂交（使用Sox5、Etv1、Ccn2 RNA探针）评估胚胎期18.5天（E18.5）和出生后0天（P0）小鼠脑片中的基因表达和细胞标记物变化。3）行为学测试：对成年（12-20周龄）小鼠进行一系列标准行为学范式，包括握力测试、转棒测试、旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫、嗅觉习惯化测试、社交选择测试、筑巢撕咬和埋珠实验。4）视频脑电图（EEG）记录与分析：在4-5月龄小鼠中植入10个电极（海马、双侧顶叶、双侧运动、双侧听觉、双侧视觉皮质），进行48小时基线EEG记录，并使用定制Python工具（NeuRodent）分析功率谱密度（PSD）、频带功率、相干性和Pearson相关系数。5）统计分析方法：采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）、广义线性混合模型（GLMM）和广义线性模型（GLM）对数据进行分析，并校正多重比较。

**研究结果（保留小标题）**

**3.1 Emx1谱系中Sox5纯合缺失的小鼠在断奶期前后生长不良并存在终身生长缺陷**
通过免疫染色和RNA原位杂交证实，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+纯合突变小鼠的新皮质深层（L5、L6、L6b）中SOX5蛋白表达完全缺失，且与Sox5^-/-全敲除小鼠类似，出现异常的细胞规格化，表现为L5标记物Etv1表达升高和L6b标记物Ccn2表达降低。这些纯合突变小鼠在断奶期前后（P18-P23）出现生长停滞和死亡，但通过补充高营养凝胶可存活；成年后体重仍比野生型小鼠轻20-30%，并表现出育儿本能缺陷。

**3.2 Sox5纯合而非杂合突变小鼠表现出自闭症样行为**
通过日常观察发现，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠在被打扰时表现出多动、重复行为、僵直样发作和雄性攻击性增强等异常行为，而杂合子小鼠未见此类定性差异。

**3.3 Sox5纯合而非杂合突变小鼠表现出任务特异性的运动功能缺陷**
在转棒实验中，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠的潜伏期显著短于野生型小鼠（约2-3倍），表明运动表现受损；但握力测试无显著差异。Sox5^+/-和Sox5^fl/+Emx1^Cre/+杂合小鼠在这两项测试中均与野生型小鼠无差异。

**3.4 Sox5条件性纯合而非杂合突变小鼠表现出焦虑减轻和多动增加**
在旷场实验中，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+和Sox5^fl/+Emx1^Cre/+小鼠均表现出中心区域探索时间增加，提示焦虑样行为减少，但后者表型更持续。高架十字迷宫测试进一步证实Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠在开放臂停留时间显著增加，总移动距离和移动时间也显著增加，表明焦虑减轻和多动。全球性杂合小鼠（Sox5^+/-）则表现出轻微的、时间依赖性的焦虑样表型。

**3.5 Sox5纯合和杂合突变小鼠分别表现出显著和轻微的学习与记忆缺陷**
Morris水迷宫测试中，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠在提示实验和获取实验中均表现严重受损，潜伏期显著长于野生型小鼠，且空间记忆测试（短期和长期）中失败率高。Sox5^fl/+Emx1^Cre/+和Sox5^+/-杂合小鼠仅表现出轻微的、性别依赖性的学习与记忆缺陷。

**3.6 Sox5纯合和杂合突变小鼠均无嗅觉缺陷**
嗅觉辨别测试显示，所有基因型小鼠均能优先探测非水气味和小鼠气味，并表现出正常习惯化，表明嗅觉功能保留，排除了嗅觉缺陷对社交和焦虑相关任务的可能干扰。

**3.7 Sox5纯合而非杂合突变小鼠表现出ASD样偏好（物体优于社交刺激）**
社交选择测试中，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠（尤其雌性）表现出对无生命物体而非社交刺激（另一只小鼠）的显著偏好，在辨别阶段物体区时间比和距离比均显著高于野生型小鼠。杂合小鼠（Sox5^fl/+Emx1^Cre/+和Sox5^+/-）与野生型小鼠无显著差异。

**3.8 Sox5纯合而非杂合突变小鼠在部分重复行为上表现出改变**
筑巢撕咬测试中，Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠利用巢料的重量显著低于野生型小鼠，表明自然筑巢动机受损；而埋珠测试中未观察到基因型间显著差异。杂合小鼠在这两项测试中均表现正常。

**3.9 EEG揭示皮质网络组织轻度、弥漫性改变**
视频EEG记录未捕获到Sox5^fl/flEmx1^Cre/+小鼠的电临床发作，但约20%的小鼠在处理刺激下出现似发作事件。功率谱密度分析显示，纯合突变小鼠的绝对和相对频带功率与野生型小鼠无显著差异，但存在日间γ功率增加和雄性小鼠δ功率上升、θ功率下降的趋势。皮质间相干性分析中，β和γ频带相干性主要受性别影响，而基因型仅与δ频带相干性呈非显著下降趋势。总体提示皮质网络组织存在轻度改变。

**总结讨论与结论翻译**

**讨论总结：** 研究人员指出，Sox5在Emx1谱系中纯合缺失的小鼠在出生时即表现出与Sox5全敲除小鼠相同的皮质表型，但由于其存活，得以进行出生后的行为学和EEG评估。这些小鼠在断奶期前后出现的生长不良可能与挑食有关，类似部分LAMSHF婴儿的喂养问题。成年小鼠的运动、焦虑、社交和学习缺陷与LAMSHF患者的临床特征一致。相比之下，杂合失活的小鼠（无论是全球性还是条件性）几乎没有表现出神经元和行为缺陷。因此，与杂合突变体相比，Emx1谱系中Sox5纯合失活的小鼠更有助于在细胞和分子水平上进一步研究SOX5的脑功能，并作为临床前模型测试LAMSHF的候选疗法。关于种间差异，研究人员推测，人类SOX5在脑中的单倍剂量不足可能更为关键，这可能与人类大脑对基因表达水平变化更敏感、需要更高表达水平以支持其更大的体积和功能复杂性有关。

**结论翻译：** 总而言之，LAMSHF儿童的行为符合一种非特异性神经发育障碍的特征，包括智力残疾、运动障碍和ASD特征性的行为异常。这些行为变化可定位于前脑的多个不同区域，但通常被认为是由弥漫性皮质改变所致。本研究表明，在兴奋性神经元和其他Emx1谱系细胞中Sox5纯合缺失的小鼠重现了这些广泛的神经发育发现，表现出重复运动、焦虑样行为、社交互动减少等行为异常，以及典型的与海马和杏仁核变化相关的学习困难，而杂合突变小鼠则表现出相似但轻微得多的特征。纯合突变小鼠的EEG模式和行为表型与皮质投射神经元的主要缺陷一致。尽管由于纯合缺失而非杂合缺失导致其与LAMSHF患者存在差异，但这一独特的小鼠模型表明，Lamb-Shaffer综合征的许多行为可至少部分归因于兴奋性神经元中SOX5的单倍剂量不足。因此，该模型应有助于对Lamb-Shaffer综合征进行分子、机制和临床前研究。