利用大规模并行测序技术对菲律宾人群中101个与身份识别相关的SNP进行法医鉴定

《Forensic Science International: Genetics》：Forensic evaluation of 101 identity-informative SNPs in a Filipino population using Massively Parallel Sequencing

　　贾泽琳·M·萨尔瓦多 | 达梅·洛夫莱斯尼斯·T·阿帕加 | 梅维维妮·V·索辛 | 克里斯蒂安·S·埃斯特雷拉 | 玛丽亚·莱安娜·帕特里斯·N·拉佐 | 杰·约瑟夫·拉塞尔·B·罗德里格斯 | 谢拉·玛丽·E·丹尼斯 | 盖维尔琳·C·卡拉卡尔 | 安布罗西奥·梅尔文·A·马蒂亚斯 | 玛丽亚·科拉松·A·德翁格里亚

菲律宾奎松市迪利曼校区菲律宾大学自然科学研究所DNA分析实验室

摘要
基于DNA的人类识别传统上以短串联重复序列作为主要遗传标记进行分析。然而，单核苷酸多态性，尤其是位于常染色体上的身份信息型SNP，在分析降解DNA时具有明显优势，因为其突变率低且扩增片段长度较短。大规模并行测序技术使得能够在一次检测中同时分析大量STR和SNP，从而提升了法医分析能力。本研究使用两种市售的大规模并行测序试剂盒（Precision ID和ForenSeq? DNA Signature Prep Kits），对菲律宾典型人群中的101个身份信息型SNP进行了分析，为法医DNA数据库提供了东南亚地区代表性不足的人群数据。研究分析了来自国家首都地区及其周边地区的143名无关菲律宾男性的基因型数据，以估算等位基因频率、法医效率参数、哈代-温伯格平衡状态、连锁不平衡现象、群体结构以及亲缘关系分析的准确性，以便在案件处理中进行更可靠的统计分析。经过校正后，所有标记均符合哈代-温伯格平衡预期，且在这些身份信息型SNP之间，或是它们与之前使用PowerPlex? 21系统及VeriFiler?直接PCR扩增试剂盒检测得到的23个常染色体STR标记之间，均未发现显著的连锁不平衡现象。这一结果支持了标记独立性的假设，也使得标准法医统计模型得以应用。在所评估的101个身份信息型SNP中，有64个符合广泛法医应用的标准。这两种SNP组合都展现出很强的个体识别能力，其联合匹配概率比23个常染色体STR标记的低五到六倍。群体遗传学分析表明，与分析中涉及的其他人群相比，菲律宾人在基因特征上与东亚人群更为接近，但这同时也凸显出针对特定人群建立参考数据的重要性。此外，模拟亲缘关系分析显示，身份信息型SNP在一级亲缘关系分析中的表现与常染色体STR标记相当，而与后者结合使用时，则能在二级亲缘关系分析中提供更多有用信息。相比之下，仅使用身份信息型SNP、仅使用常染色体STR标记，或两者结合使用的标记系统均无法可靠地判定三级亲缘关系，这进一步说明了需要更高密度的身份信息型SNP标记组合。本研究建立了首个菲律宾人用法医身份信息型SNP数据库，并验证了两种市售大规模并行测序试剂盒中所包含的101个此类SNP的法医应用价值。未来的研究应将这些分析扩展到菲律宾的其他人群群体，包括在文化和地理上与主流人群存在差异的土著文化群体和土著民族。此外，优化通用的身份信息型SNP标记组合，以及探索更高密度的大规模并行测序数据集，或许有助于发现新的标记，进而进一步提升菲律宾刑事调查中的法医DNA分析能力。

1. 引言
法医DNA分析是刑事侦查、灾难遇难者身份识别以及复杂亲缘关系案件处理中用于人类识别的核心工具。自20世纪90年代中期以来，通过毛细管电泳技术进行分型的短串联重复序列已成为法医遗传学的黄金标准。由于具有极高的区分度，常染色体STR标记构成了全球法医DNA数据库的基础框架，其中包括美国的综合DNA索引系统。在欧洲，这类数据库则采用标准化标记组合构建，如欧洲标准标记集；而中国的一些国家数据库也会使用额外的常染色体STR标记组合。然而，许多传统的常染色体STR标记需要较长的扩增片段，通常超过200个碱基对，这使得它们在分析降解严重的DNA样本时作用有限。这些局限性促使人们开始关注那些在复杂法医条件下能更可靠工作的替代标记系统。单核苷酸多态性正是这样的一种替代选择，因为可以使用比常染色体STR标记更短的扩增片段（约50–100个碱基对）来检测它们。由于较小的DNA片段在降解严重的DNA样本中更有可能保持完整，因此SNP检测通常比传统的常染色体STR标记分析更适用于处理降解或模板量极低的DNA样本。此外，SNP的突变率较低，因而能够在不同世代间保持稳定性，降低亲缘关系或亲子鉴定中出现错误匹配的概率。根据其法医应用场景，SNP可被分为身份信息型、谱系信息型、祖先信息型以及表型信息型。其中，身份信息型SNP因其较高的杂合度以及较低的群体间差异性，而被选用于直接进行人类身份识别和亲缘关系分析，这类特性有助于其在不同人群中实现广泛的法医应用。不过，群体研究显示，并非所有的身份信息型SNP都能始终满足这些标准，这就需要针对特定人群进行进一步验证。此外，常用法医标记组合中的身份信息型SNP多为双等位基因类型，因此产生的基因型组合数量少于多等位基因型的常染色体STR标记。这样一来，通常需要大约50–100个身份信息型SNP才能达到与13–22个常染色体STR标记相当的区分度。这一要求使得在采用低通量分析方法（如基于毛细管电泳的单碱基延伸检测技术）进行检测时，这些SNP难以得到常规法医应用。大规模并行测序技术的发展大大克服了这一限制，它使得能够在一次检测中同时分析大量身份信息型SNP标记。目前已有几种市售的法医大规模并行测序试剂盒将身份信息型SNP纳入经过验证的多标记组合中用于分析。较早推出的产品包括曾经的HID-Ion AmpliSeq Identity Panel（现由赛默飞世尔科技公司以Precision ID Identity Panel的名称销售），以及分别于2014年和2015年推出的ForenSeq? DNA Signature Prep Kit（由Verogen公司生产）。Precision ID标记组合包含90个身份信息型SNP和Y染色体SNP，而ForenSeq?试剂盒则包含94个身份信息型SNP，同时还涵盖常染色体、Y染色体和X染色体的STR标记，以及祖先信息型SNP和表型信息型SNP。这些大规模并行测序试剂盒已经经过了大量测试，尤其适用于处理难度较高的样本，如骨骼、组织样本等，同时也已在多项群体研究中得到了应用。如果将这两种试剂盒中所包含的所有身份信息型SNP加起来，总共就有101个不同的此类SNP，且这两种试剂盒之间的标记存在较多重叠。先前的研究已证明，这两种试剂盒中所共有的身份信息型SNP在检测结果上具有高度一致性，这也证明了它们适合用于法医SNP基因分型。不过，虽然这些身份信息型SNP是被挑选出来因其在不同人群中具有良好的法医应用性能，但最初用于发现和验证这些SNP的数据集主要来自欧洲、北美、非洲以及东亚部分地区，东南亚人群的代表性相对不足。因此，有必要在东南亚人群背景下进一步评估这些身份信息型SNP的法医应用价值，以避免出现潜在的判定偏差。本研究旨在评估Precision ID和ForenSeq?试剂盒中所包含的101个身份信息型SNP在菲律宾人群中的法医应用性能。菲律宾的人口结构极为复杂，这是由其群岛地形以及历史上的移民活动所决定的，该国拥有约182个具有独特语言和文化特征的族群。在这种背景下，针对特定人群的等位基因频率数据以及连锁不平衡分析结果，对于在法医案件中进行准确统计分析至关重要，尤其是在计算匹配概率和似然比时。如果缺乏这类针对特定人群的数据，在将基于大规模并行测序技术的SNP标记组合应用于菲律宾样本时，就可能导致在个体识别和亲缘关系分析中低估或高估统计权重。此外，本研究还将菲律宾人的数据与已公布的全球人群数据集进行比较，以分析其群体结构。同时，也对亲缘关系分析的性能进行了评估，以此判断这两种试剂盒是否适合在菲律宾的法医应用中使用。通过建立首个针对菲律宾人的法医身份信息型SNP参考数据库，本研究为进行准确的统计分析提供了必要的群体特异性数据，同时也支持在法医DNA分析中将身份信息型SNP与传统的STR标记相结合使用。

2. 材料与方法
2.1 伦理声明
所有实验程序均获得了菲律宾大学马尼拉研究伦理委员会的批准（编号为UPMREB 2014-499-01）。DNA样本来自之前参与某项研究项目的志愿者（编号为UPMREB 2012-0247-NIH）。所有参与者均签署了书面知情同意书，同意其生物样本可在未来研究中被再次使用。

2.2 人群与测序
本研究分析了来自国家首都地区及其周边地区的143名无关菲律宾男性的基因型数据。这些数据全部来自之前已有常染色体STR标记数据的男性样本集合。这一事实可能限制了这些等位基因频率及群体遗传学结论在更广泛人群中的适用性。这些样本此前已经使用HID-Ion AmpliSeq? Identity Panel（现由赛默飞世尔科技公司以Precision ID Identity Panel的名称销售）以及ForenSeq? DNA Signature Prep Kit Primer Mix B（由Verogen公司生产）进行了基因分型。关于样本采集、DNA提取、文库构建、测序流程、测序深度以及等位基因覆盖率的详细信息此前已有报道。

2.3 SNP标记与数据集
本研究共分析了Precision ID和ForenSeq?试剂盒中所包含的101个身份信息型SNP。这101个SNP在22对常染色体上的位置如图S1所示。此前已有研究评估过这两种大规模并行测序平台在分析菲律宾样本时的一致性。在评估一致性之前，首先使用ForenSeq? Universal Analysis Software v1.3（由Verogen公司开发）生成的这些身份信息型SNP的基因型数据被转换为正向序列格式。对于所有标记，均得到了一致性的基因型判定结果，这些结果被保留下来用于后续分析。对于那些基因型判定结果不一致的样本，则依据等位基因覆盖率以及读段深度标准来确定最终的基因型结果。之后，这些整合后的数据集被利用R语言中的biomaRt包映射到GRCh38参考基因组上。

2.4 哈代-温伯格平衡与连锁不平衡
本研究使用Arlequin v3.5.2.2软件对这101个身份信息型SNP的哈代-温伯格平衡状态以及连锁平衡状态进行了分析。在检测哈代-温伯格平衡时，设置了1×10^6次马尔可夫链迭代步骤以及1×10^5次去记忆化步骤，以此判断每个标记的基因型频率是否符合随机交配条件下的群体遗传学预期。如果出现显著偏差，可能意味着存在基因型测定错误、群体亚结构、近亲繁殖或选择压力等因素，这些因素都可能影响等位基因频率的估算结果，进而影响法医统计分析的准确性。另一方面，研究还通过检测所有成对身份信息型SNP之间的连锁不平衡现象，来评估标记之间的独立性——这一独立性是法医分析中运用乘积规则计算匹配概率和似然比时的重要前提。在检测连锁不平衡时，使用了10,000次排列组合以及期望最大化算法的两种初始条件，对这101个身份信息型SNP的所有成对组合进行了分析。此外，为了在将常染色体STR标记与身份信息型SNP结合进行亲缘关系分析之前，进一步评估标记之间的独立性，研究还使用了相同的参数，检测了这些身份信息型SNP与在同一组143名个体中通过PowerPlex? 21和VeriFilerTM Direct技术检测得到的23个常染色体STR标记之间的连锁不平衡程度。在进行哈代-温伯格平衡和连锁不平衡分析时，均采用了Benjamini–Hochberg假发现率校正方法来调整p值，以解决多重检验带来的问题。在处理连锁不平衡分析时，还将所有成对比较分为两类：位于同一染色体上的标记，以及位于不同染色体上的标记，然后分别对这两类标记应用多重检验校正措施。

2.5 等位基因频率与法医参数估算
等位基因频率以及各种法医统计参数，包括观测杂合度、预期杂合度、多态性信息含量、匹配概率、区分度以及典型父权指数，都是使用STR Analysis for Forensics（STRAF）v2.2.2软件在本地服务器上计算得出的。此外，研究还计算了综合匹配概率、综合区分度以及综合排除度，以此全面评估每种身份信息型SNP标记组合的总体区分能力。

2.6 群体结构与遗传分化分析
为探究菲律宾人及其他全球人群之间的群体结构及遗传关联，本研究将身份信息型SNP数据集与人类基因组多样性项目提供的公共数据集进行了合并。在合并过程中，仅保留了无关个体，而样本量低于10的群体则被排除在群体遗传学比较分析之外。所有后续分析均使用经过筛选后的基因型数据集进行。群体结构的分析是通过ADMIXTURE v1.3.0软件完成的。分析时设定的K值范围为2到7，每个K值对应的重复分析次数为20次。每个K值对应的重复分析结果会通过CLUMPP v1.1.2软件进行比对和汇总，最终的结果则通过R语言中的pophelper v2.3.1软件进行处理和可视化展示。此外，还使用R语言中的hierfstat软件，结合菲律宾人群与全球其他人群的混合数据集，估算了各标记对应的Weir和Cockerham FST值以及平均杂合度。2.7 亲缘关系分析与模拟
为评估iiSNPs在分析菲律宾样本亲缘关系方面的性能，研究人员使用iiSNP基因型数据进行了模拟实验。由于iiSNPs主要用于补充aSTRs，因此还同时进行了aSTRs的平行模拟，以便直接比较仅使用iiSNPs、仅使用aSTRs以及结合二者使用的分析结果。模拟的iiSNP基因型是基于本研究中估算的菲律宾等位基因频率以及每代1.29×10??的平均SNP突变率生成的。这一突变率与大规模人类测序研究确定的整个基因组的平均单核苷酸突变率一致，也曾被用于之前的亲缘关系模拟分析中[51][52]。针对Precision ID试剂盒中所包含的90个iiSNP标记以及ForenSeq?试剂盒中的94个iiSNP标记分别进行了模拟。与此同时，还利用已公布的菲律宾等位基因频率[34]以及各标记特有的突变率[53]，对23个aSTR标记的基因型数据进行了模拟。选择这些标记集是为了反映当前法医实验室实际使用的系统，便于在不同标记集之间进行直接比较。此外，还假设23个aSTR标记与Precision ID或ForenSeq?试剂盒中的iiSNP标记之间相互独立，从而进行了结合aSTR与iiSNP的模拟分析，这一假设与2.4节中描述的LD分析结果一致。

对于每一组标记，都使用Familias v3.4软件[54]模拟了10,000对基因型组合，用以分析以下亲缘关系场景：父母与子女（三联体和双联体）、全同胞、半同胞、祖父母与孙辈、叔伯与侄子/侄女、表兄妹以及无亲缘关系的个体。对于每对模拟的基因型组合，都通过Familias v3.4中实现的标准法医统计模型，计算出在给定亲缘关系假设下 versus 无亲缘关系假设下的似然比LR值。首先通过接收者操作特征曲线ROC分析来评估区分性能，其中以Familias v3.4生成的LR值为预测因子，而真实的亲缘关系状态（有亲缘关系 vs 无亲缘关系）则为二元响应变量。针对每种亲缘关系场景和标记组合，都绘制了ROC曲线，并依据评估亲缘关系分析中基因标记组合的常用方法，通过ROC曲线下面积AUC来总结分析性能[55]。所有的ROC和AUC分析都是使用R语言中的pROC包[56]完成的。AUC值会报告95%置信区间，并通过DeLong的非参数检验方法比较不同标记组合之间的差异[57]。之所以假设存在相关性，是因为在每种标记组合下都会对相同的模拟基因型对重新计算LR值（仅aSTR、仅iiSNP以及结合二者）。为使比较标准化，以23个aSTR标记组合作为参考，其他所有标记组合均与之进行对比。多重检验校正采用Holm逐步剔除法，统计显著性水平设定为α=0.01——这一较为保守的阈值是为应对大量模拟次数（N=10,000）而设定，旨在降低在标记组合性能比较中出现第一类错误的风险。采用更严格的显著性水平并结合Holm校正方法，有助于控制因在多种模拟场景中进行统计比较而带来的第一类错误风险增加的问题[58]。

除了基于ROC-AUC的评估之外，还计算了与阈值相关的性能指标，用以评估在固定阈值以及基于数据驱动的LR阈值条件下的实际决策性能。针对一组固定的LR阈值（1、5、10、20、50、100、150和1000），分别计算了每种亲缘关系场景和标记组合的敏感性、特异性、阳性预测值PPV、阴性预测值NPV、总体准确率、假阳性率FPR、假阴性率FNR以及Youden指数。PPV和NPV是在50%为亲缘相关、50%为无亲缘关系的模拟比例条件下计算的，这样便于在相同条件下直接比较不同标记组合的性能。Youden指数（J = 敏感性 + 特异性 – 1）用于反映真阳性和真阴性率之间的平衡程度，其取值范围从0（无法超越随机水平的区分能力）到1（完美分类）[59]。这些指标都是通过判断模拟基因型对对应的LR值是否超过指定阈值，从而将其归类为有亲缘关系或无亲缘关系而得出的。

所有的统计分析以及性能指标的计算都是使用R语言完成的。用于处理Familias v3.4中生成的模拟LR值、进行ROC分析、优化阈值以及计算各类指标的脚本，均可在https://github.com/apagadlt/Kinship-Testing网站上获取。尽管之前的研究已经提出了用于估算区分性能的分析近似方法，比如预测的ROC曲线下面积AUCP[55]，但本研究则是直接基于模拟得到的LR分布来给出实证性的性能估算结果。利用38个全球人群中的101个具有身份信息功能的SNP，包括菲律宾人，计算出了成对Weir和Cockerham FST值。（A）成对FST值的热图，颜色越暖表示遗传分化程度越高。（B）基于相同成对FST距离矩阵得出的多维尺度分析图，以二维空间展示各人群之间的遗传关系。为进一步研究亚洲内部的精细遗传结构，还使用了仅来自亚洲人群的ADMIXTURE分析，并结合了SGDP和GAsP的参考数据。由于不同数据集中的标记可用性存在差异，该分析仅使用了100个重叠的iiSNP。所得的祖先构成模式与全球分析结果一致，菲律宾人群与东南亚人群聚集在一起（图S2）。由于标记数量减少以及加入了更多亚洲参考人群，祖先比例存在轻微差异。

3.3 模拟亲缘关系分析
通过模拟亲缘关系分析，评估并比较了不同标记组合（仅iiSNP、仅aSTR以及iiSNP与aSTR结合使用）在不同亲缘关系场景下的性能。通过无阈值ROC分析和基于LR决策阈值的阈值依赖型指标来评估区分能力，从而判断其整体分辨率及基于证据的决策能力。
在所有标记组合中，随着亲缘关系程度的增加，区分能力下降，反映出亲属间的基因共享减少。这一趋势在基于ROC的和基于阈值的性能指标中均有所体现。对于一级亲缘关系，包括父母与子女的组合、双亲组合以及同父同母/同父异母兄弟姐妹，ROC分析显示出近乎完美的区分能力，AUC值在0.999到1.000之间（表S8）。亲缘相关与无关组合的LR分布几乎没有重叠（图S3）。在三人组及二人组场景中，五种标记组合的LR分布和ROC曲线几乎完全相同（图S3和S4），成对AUC比较也未显示出统计学上的显著差异（p值接近1）（表S8）。基于阈值的分析结果也与此一致，所有固定LR阈值（1–1000）下，灵敏度、特异性和总体准确率均很高，假阳性率和假阴性率极低（假阳性率≤0.02%，假阴性率≤1.39%），Youden指数值超过0.98（表S9）。
对于同父同母/同父异母兄弟姐妹关系，所有标记组合仍表现出极高的区分能力，ROC曲线接近理想的分离点(0,1)（图S4）。iiSNP与aSTR结合使用的标记组合相比仅含iiSNP或仅含aSTR的标记组合，AUC值有轻微但统计学上显著的提升（p<0.01）。不过绝对差异仍然较小，所有标记组合都保持着近乎完美的性能（表S8）。基于阈值的分析结果也一致，单标记组合在LR阈值1-10时总体准确率≥99%（表S9）。而iiSNP与aSTR结合使用的标记组合在LR阈值10到1000时，灵敏度及Youden指数值更高（表S9）。
对于二级亲缘关系，如同父异母/同母异父兄弟姐妹、祖父母与孙辈以及叔伯与侄子/侄女等关系，由于等位基因共享程度降低，对标记的信息量要求更高。此时AUC值在0.955到0.997之间，表明区分能力较高但有限（图S4，表S8）。通过DeLong检验并结合Holm逐步剔除法进行的AUC成对比较，证实不同标记组合之间存在统计学上的显著差异。与单标记组合相比，iiSNP与aSTR结合使用的标记组合始终具有更高的平均AUC值（约0.996）（表S8），LR分布分离更明显（图S3），ROC性能也更优（图S4）。相应地，随着标记数量的增加，AUC估计值的95%置信区间逐渐缩小，说明精度有所提升（图4）。基于阈值的分析进一步凸显了这些差异。在固定LR阈值下，结合使用的标记组合的灵敏度高于仅含iiSNP的标记组合，同时假阴性率更低（表S9）。不过，在二级亲缘关系中，当LR值大于10时，结合使用的aSTR-iiSNP标记组的Youden指数值低于0.90。

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图4. 不同法医标记组合在二级和三级亲缘关系中的曲线下面积（AUC）值及其95%置信区间，所涉及的亲缘关系类型包括同父异母/同母异父兄弟姐妹、祖父母与孙辈、叔伯与侄子/侄女以及表兄弟姐妹。
在三级亲缘关系中，即表兄弟姐妹关系，区分能力出现最明显的下降。不同标记组合的AUC值降至0.797–0.904之间（图4和表S8），ROC曲线则向代表随机分类的对角线靠拢（图S4）。仅含iiSNP的标记组合表现最差，90-iiSNP和94-iiSNP标记组合的AUC值分别为0.797和0.810。基于阈值的分析进一步凸显了这些限制，当LR值≥5时，仅含iiSNP的标记组合的灵敏度下降，假阴性率上升至70%（表S9）。值得注意的是，将iiSNP与aSTR结合使用，显著提升了三级亲缘关系的区分能力，使平均AUC值升至0.9以上，不过在各个LR阈值下，Youden指数值仍低于0.90（表S9）。

4 讨论
本研究评估了在菲律宾人群中常用iiSNP标记的性能。菲律宾是一个高度多元化的群体，但在当前法医iiSNP标记组合的开发和验证过程中，该群体的代表性不足。通过结合法医效率评估、群体遗传特征分析以及模拟亲缘关系分析，本研究全面分析了iiSNP在菲律宾人群中的表现，以及它们如何补充现有的aSTR系统。
本研究构建的菲律宾iiSNP数据集满足法医统计分析所需的关键假设。经过多重检验校正后，所有标记都符合哈代-温伯格平衡预期，这为使用基于平衡假设的似然计算提供了依据。此外，尽管在校正前有几对标记显示出显著的连锁不平衡，但经过BH-FDR校正后，这些关联均不再具有统计学显著性，说明在这些人群数据中，iiSNP在很大程度上是独立发挥作用的。对101个iiSNP与23个aSTR进行的连锁不平衡检测同样显示，校正后不存在显著的关联。iiSNP之间以及iiSNP与aSTR之间不存在显著连锁不平衡，这与法医iiSNP标记组合构建时的标准之一相符——即所选标记在遗传上是独立的，且分布在基因组的不同位置，以此降低连锁效应，提高标记间匹配概率和似然比的估算准确性[30]。因此，这些结果支持在以往研究[34]以及本研究中所使用的菲律宾aSTR和iiSNP数据库中进行法医计算时应用乘法规则。
本研究观察到的法医效率参数体现了iiSNP在个体识别方面的实用性。Precision ID（90个iiSNP）和ForenSeq?试剂盒（94个iiSNP）的综合法医参数给出的CMP值极低，约为10^-33到10^-34，而23个aSTR标记组的CMP值约为10^-28。这些结果表明iiSNP在个体识别方面具有巨大潜力，这一结论与其他基于MPS的iiSNP人群研究结果一致[13]、[39]、[60]、[61]、[62]、[63]、[64]、[65]。由于aSTR和iiSNP在遗传特性上的差异，二者在法医参数上存在区别。aSTR为多等位基因标记，通常每个标记的杂合度更高，而本研究中的iiSNP为双等位基因标记，因此单个标记的信息量较低[2]。不过，iiSNP标记组合通常包含更多独立的标记，这能大幅提升组合的总体信息量，从而产生极低的CMP值。因此，iiSNP标记组合在区分无关个体方面具有很强的区分能力。基于本研究分析的标记组合和菲律宾等位基因频率数据集，中等规模的iiSNP标记组合在应用于相关人群参考数据库时，具备适用于常规法医身份鉴定的区分能力。
群体遗传学分析为这些法医研究结果提供了重要背景。在混合分析和成对FST分析中，菲律宾人与东亚和东南亚人群的聚类程度最为接近，这一结果与之前使用其他标记系统对同一菲律宾人群进行的区域遗传亲缘性研究结果一致[34]、[66]、[67]。不过，多变量分析中的聚类反映的是整体遗传相似性，并不意味着等位基因频率分布完全相同。此外，法医统计参数如LR值和MP值直接取决于等位基因频率，哪怕是微小的差异也会影响其计算结果。因此，尽管存在广泛的区域聚类现象，但为了确保法医计算的准确性和无偏性，仍需使用针对特定人群的参考数据库。
本研究中的样本来自菲律宾的政治、经济和行政中心NCR地区，该地区是政府、商业、教育和就业的核心地带。作为国内移民的主要目的地，NCR汇集了来自群岛各地不同民族语言群体的居民，历来也是国际贸易和交流的重要中心。虽然研究参与者自我报告的祖先可追溯至两代以内，但更远的祖先血统可能并未被完全记录下来。这些未被考虑的祖先血统或许解释了为何菲律宾人与周边人群存在遗传亲缘性，同时也进一步凸显了在法医分析中使用针对特定人群的等位基因频率数据库的必要性。
对全球范围内101个iiSNP标记的分析显示，虽然大多数标记保持了较高的杂合度且群体间的分化程度较低，但仅有64个标记同时满足杂合度（Ht ≥ 0.40）和群体分化程度（FST ≤ 0.06）的两项推荐标准[4]、[5]。由于iiSNP标记组合的设计目标就是包含杂合度较高且群体间分化较小的标记，因此这64个iiSNP标记有望成为具有全球适用性的标记组合候选者。不过，那些超过这些标准的标记可能反映了特定人群的等位基因频率特征，当存在群体结构时，这些特征可能会影响法医统计计算。即便如此，当这些标记被纳入更大的基于MPS的标记组合中进行分析时，仍能提供有用信息。在法医遗传学中，FST所反映的群体分化概念上与共祖系数θ相关，后者用于在基因型概率计算中考虑群体亚结构的影响。因此，较低的FST值意味着无需进行较大的群体亚结构校正，也就体现了这些标记在不同人群中的广泛适用性。这些研究结果强调了针对特定人群对法医标记组合进行评估的重要性，以及建立菲律宾等位基因频率数据库的必要性，这样才能确保法医统计结果的准确性，尤其是对于那些在全球法医数据集中代表性不足的人群。
模拟亲缘关系分析明确了不同亲缘关系场景下iiSNP标记组合的性能。对于一级亲缘关系，包括亲子鉴定相关的三人和两人组合，iiSNP标记组合的表现与aSTR相当，能够近乎完美地区分亲缘相关与无关的个体，且在不同的决策阈值下，其灵敏度、特异性和准确率均保持较高水平。值得注意的是，菲律宾《DNA证据规则》规定的LR阈值（LR ≥ 1000），对应着99.9%的亲子概率（假设先验概率为50%），这一阈值无论用于iiSNP标记还是aSTR标记的亲子鉴定都是合适的[68]。这些研究结果支持在菲律宾继续沿用现有的亲子鉴定法律规范。
对于同父同母/同父异母兄弟姐妹以及二级亲缘关系，其区分能力虽低于亲子鉴定，但仍具有一定的信息价值。较低的LR阈值（如≤1000）在实际应用中也可能具有参考意义，尤其是在有额外的家系信息或参考个体支持的情况下。在某些场景下，仅含aSTR的标记组合相比仅含iiSNP的标记组合，能更有效地区分亲缘相关与无关个体，这是因为aSTR标记的每个标记具有更高的多态性和杂合度。不过，将iiSNP与aSTR结合使用，可以提高灵敏度并降低假阴性率，这体现了整合型标记组合在检测更远亲缘关系时的优势[69]。这些研究结果进一步证明了iiSNP作为aSTR的补充标记的作用，而非替代品，尤其适用于缺乏一级亲属的情况，或是当DNA质量较差导致无法完整获取aSTR DNA谱型时[70]、[71]。
对于三级亲缘关系，如表兄弟姐妹关系，无论是仅含iiSNP的标记组合、仅含aSTR的标记组合，还是iiSNP与aSTR结合使用的标记组合，在常用的LR阈值下，都无法提供足够的区分能力。这些研究结果凸显了中等规模iiSNP标记组合在推断远亲关系时的根本局限性，尤其是在遗传多样性较高的人群中。正如专为亲缘关系分析设计的高密度SNP标记组合所展现的那样，如果将标记密度提高到100个以上，并结合合适的参考数据库和分析框架，有望提升对远亲关系的区分能力。
总体而言，本研究结果表明，在所评估的标记组合适用范围内，常用的iiSNP标记组合适合用于菲律宾人群的法医应用。平衡性和独立性假设得到验证，综合法医效率指标表现优异，且与aSTR结合使用时区分能力更强，这些都体现了iiSNP作为aSTR的辅助法医标记的价值。同时，由于远亲关系判定的分辨率有限，因此在解读结果时需格外谨慎，并且需要进一步开发更高密度的标记集。本研究受限于菲律宾样本的范围，而该国在民族语言和地理方面存在极大多样性，这可能掩盖影响等位基因频率、连锁模式以及亲缘关系判定指标的更细微的人群亚结构。对于二阶和三阶亲缘关系的推断而言，这类亚结构尤为重要，因为适度的频率差异就会显著影响似然比分布[33]。此外，本研究中分析的菲律宾数据集仅包含男性个体，这可能会限制等位基因频率估算的代表性。另一个局限是，用于比较群体遗传学分析的部分人群样本量相对较小，这是由于全球参考数据集的设计侧重于广泛的地理覆盖。虽然这些数据集主要用于比较遗传多样性和群体分化情况，但增加每个群体的个体数量可以提高群体分化估算的精确度，比如θ值或FST值，这些数值在法医遗传学中可用于考虑人群亚结构，并调整DNA证据解读中的基因型概率和似然比计算[74]。因此，未来的研究应扩大样本范围，纳入更多菲律宾的民族语言群体，并同时包含男性和女性个体，以便更全面地反映群体遗传多样性。增加样本量和地理覆盖范围将有助于构建更为完善的菲律宾法医数据库，进而提升亲缘关系分析中DNA证据的解释能力。涉及原住民文化社区/原住民的研究必须遵循伦理、法律及社区治理框架，包括通过菲律宾原住民委员会落实自由、事先且知情同意程序[75]、[76]，以及按照菲律宾国家伦理指南进行机构研究伦理审查[77]。此类研究应注重与社区的透明沟通、符合文化背景的咨询以及负责任的数据管理，以确保基因组研究是在与原住民社区合作并尊重其权利和利益的前提下开展的[78]。基于本研究对具有代表性的菲律宾人群中iiSNP标记组的评估，未来的工作应拓展到符合伦理标准的群体研究，并优化那些能在不同人群中提供广泛信息的iiSNP标记。此外，对更高密度MPS标记组的评估将有助于构建更为可靠的法医群体数据库，推动MPS技术在菲律宾法医亲缘关系鉴定中的广泛应用[79]。

5. 结论
本研究对菲律宾人群中常用的iiSNP标记进行了全面的法医评估。菲律宾人群虽具有高度多样性，但在法医SNP标记的开发中却一直未被充分重视。菲律宾的iiSNP数据集满足了法医分析的关键假设，包括 Hardy-Weinberg 平衡和标记独立性，且既不存在iiSNP之间的连锁现象，也不存在iiSNP与aSTRs之间的连锁现象。这为标准法医统计模型及联合似然计算的有效性提供了支撑。Precision ID和ForenSeq? iiSNP标记组在菲律宾人群的个体识别方面展现出巨大潜力。群体遗传学分析强调了因不同全球人群中标记表现存在差异而需要进行群体特异性验证的重要性。模拟亲缘关系分析表明，在菲律宾现行法律规定的阈值范围内，iiSNP适用于一阶亲缘关系鉴定；与aSTRs结合使用时，可进一步提升二阶亲缘关系鉴定的准确性；但仅靠iiSNP则不足以可靠地推断三阶亲缘关系。总体而言，这些研究结果支持将iiSNP作为综合iiSNP–aSTR分析流程中的辅助法医标记，同时也凸显出需要扩大样本规模并使用更高密度的iiSNP标记组，以提升菲律宾法医领域中亲缘关系判定的精度。

资金支持
本研究由菲律宾科技部——菲律宾健康研究与发展委员会（DOST-PCHRD项目编号：FP 150024和FP190023）以及菲律宾大学迪利曼分校自然科学研究所（NSR-26-1-04）提供资助。

作者贡献说明
Ma. Leana Patrice N. Lazo：写作——审阅与编辑、可视化。Ambrocio Melvin A. Matias：写作——审阅与编辑、可视化、形式分析。Gayvelline C. Calacal：写作——审阅与编辑、研究、概念设计。Sheila Marie E. Dennis：写作——审阅与编辑、研究、资金获取。Jae Joseph Russell B. Rodriguez：写作——审阅与编辑、资源协调。Dame Loveliness T. Apaga：写作——审阅与编辑、可视化、研究、形式分析、数据管理。Jazelyn M. Salvador：写作——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、研究、资金获取、形式分析、数据管理。Maria Corazon A. De Ungria：写作——审阅与编辑、资源协调、资金获取、概念设计。Christian S. Estrella：写作——审阅与编辑、可视化。Maeviviene V. Sosing：写作——审阅与编辑、可视化。

关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
在撰写本文时，作者使用了Grammarly和ChatGPT-5来提升文档的可读性。在使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表的文章承担全部责任。