用于估算血迹沉积时间的定量DNA/RNA片段分析方法

《Forensic Science International: Genetics》：Quantitative DNA/RNA fragmentation assays for estimating the time since deposition (TsD) of bloodstains

　　洪霞|莫晓婷|周哲|李阳|王哲|赵东|孙启帆中国北京100850，公安部物证鉴定中心生物信息学实验室摘要血迹形成时间是法医案件侦办中的重要依据，但目前可靠的估算方法仍较为有限。本研究旨在寻找一种最优的定量PCR方法用于估算血迹形成时间，分析影响核酸稳定性的因素，并构建适用于人类的推断模型。研究共准备了244份人类血迹样本（238份用于标记物评估和模型构建，6份[T1–T6]用于独立验证），这些样本在不同时间、温度和基质条件下制备，分为两组；此外还准备了11份动物样本用于检测引物的物种特异性。最初从现有文献中选出6个候选标记物，通过LinRegPCR分析、物种特异性测试和标准曲线评估进一步筛选，随后使用多种参考基因稳定性分析工具检测其稳定性。通过相关性分析、线性回归和曲线拟合来构建和验证模型，最终保留了4个合格标记物，其中COX1和16S rRNA被确认为仅存在于人类体内。在所研究的条件下，目标基因的短片段表现出与传统内参基因相当的表达稳定性，这为我们提供了首个实验证据，证明了此前未经正式验证的假设。在比较的四种基于qPCR的量化指标中，同标记物相对表达比率方法与血迹形成时间的关联度最高，且能减少因性别差异带来的个体间变异。核酸稳定性受标记物类型、片段长度、储存时间、温度、基质和性别的共同影响，其中储存时间是最大的外部影响因素。最终选择了8个性能优异的模型（25℃下的样本集1有2个模型，样本集2有6个模型，血液卡、棉签和纱布三种基质各2个模型），这些模型对短期（≤2个月）样本的R2值均大于0.6，对长期（最长2年）样本的R2值均大于0.8，且T1–T6所有样本的平均绝对百分比误差均低于30%。因此，本研究提出同标记物RER方法是一种有效的基于qPCR的法医血迹形成时间估算方法。1. 引言血迹是犯罪现场最常见的生物证据之一。它们不仅能为确定死亡时间和事件发生时间提供关键参考，还能协助重建犯罪现场和破案。传统上，估算血迹形成时间的方法主要依赖于物理化学特性（如颜色变化和血细胞形态）以及生化成分（如酶活性和离子组成）[1]、[2]。然而，这些方法的准确性较低，灵敏度不足，且对样本要求严格，严重限制了其在常规法医实践中的应用[1]、[2]。分子生物学的进步显著提高了核酸检测的灵敏度和特异性，因此干燥血迹中核酸的系统性降解规律成为研究重点。目前已有多种分析技术被应用于此领域，包括毛细管电泳[3]、下一代测序[4]以及定量实时PCR技术[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。其中，qPCR被公认为核酸量化的金标准，在RNA分析方面表现尤为出色。因此，开发高效可靠的基于qPCR的血迹形成时间估算方法已成为该领域的核心研究方向。目前基于qPCR的核酸量化策略可从计算方法和标记物类型两个维度进行分类。就计算方法而言，相对表达比率方法是通过对比两种稳定性不同的目标物的量化结果来计算比值[5]、[6]、[7]、[8]、[18]、[19]、[20]，该比值也被称为降解率[5]，可反映核酸质量随时间的变化情况。而相对表达方法则是通过计算两种目标物的量化循环差值ΔCq来反映核酸数量的变化[9]、[10]、[11]。就标记物类型而言，无论是不同标记物方法还是同标记物方法，都可以将两种稳定性不同的核酸标记物配对使用，或者将同一标记物的不同长度片段配对使用。结合这两个维度可得到四种量化指标，但目前尚未有系统性的比较研究。尽管这四种指标存在差异，但它们的设计逻辑是一致的：即使用高度稳定的组分作为数据标准化的参考，而使用稳定性较低的组分作为目标变量。在不同标记物方法中，参考组分通常是传统的内参基因（如ACTB）[5]、[6]、[9]、[12]、[13]、[14]；而在同标记物方法中，则是短片段[13]或目标基因本身的3’端[15]、[16]。目前仍有两个关键问题尚未解决。首先，同标记物方法中使用的短片段是否具备与传统参考基因相当的表达稳定性和数据标准化能力，目前尚未通过实验验证；以往采用该方法的研究都是直接使用该片段，并未进行正式验证。其次，不同标记物方法中的两种标记物是独立调控的，其表达水平容易受到生理和病理因素的影响，不一定能保持固定的细胞内比例，这可能会因个体间表达差异而影响估算精度[9]、[13]、[17]。虽然同标记物方法理论上可以避免这种差异[13]，但这一优势尚未得到实验验证。当前研究中还存在其他一些有待填补的空白。首先，在现有的基于qPCR的血迹形成时间研究里，很少有研究系统性地验证其推断方法的物种特异性[6]、[8]，而在法医实践中，由于犯罪现场的血迹常常与动物血液混合存在，因此物种区分非常重要。其次，DNA通常被认为化学稳定性过高，无法准确反映从痕迹形成至今的时间，因此其在血迹形成时间估算中的应用仍存在争议[3]、[6]、[8]、[12]、[13]。在之前的研究中，我们的团队首次基于线粒体标记物COX1建立了专门用于人类血迹形成时间估算的模型，初步证明了基于DNA的估算方法是可行的[8]。不过那项研究样本量较小，且未对同标记物RER方法进行系统评估。为了解决这些未解决的问题，本研究制定了以下目标：（1）系统比较四种基于qPCR的核酸量化指标，确定最适合法医血迹形成时间估算的方法；（2）深入分析影响干燥血迹中核酸稳定性的内在和外在因素；（3）验证同标记物RER方法的理论优势，包括其短参考片段的内部控制功能以及降低个体间变异的能力；（4）筛选出最优标记物，尤其注重其人类特异性；（5）构建适用于不同条件的稳健血迹形成时间估算模型。需要说明的是，这里研究的四种量化指标不仅可用于血迹形成时间估算，还可用于头发[18]、唾液和精液[19]、[20]、[21]等其他法医样本的形成时间估算，以及其他学科中的核酸稳定性研究[22]、[23]。因此，本研究的结果旨在填补现有知识空白，为法医领域血迹形成时间推断问题提供实用解决方案，同时为多个领域的核酸稳定性研究提供实证数据和理论支持。2. 材料与方法2.1 遵循MIQE指南为确保此处报告的qPCR结果具有可靠性和一致性，我们在适用的情况下报告了符合MIQE指南[24]要求的必要信息。2.2 样本人类血迹样本：共准备了244份人类血迹样本，分为两组。样本集1包含130份样本，这些样本是在七个不同时间点采集的（以新鲜样本[第0天]作为阳性对照，其余样本分别储存1天、3天、1周、2周、1个月和2个月）。样本的基质为棉签，储存条件为两种：相对湿度控制在50%的25℃环境，以及相对湿度未控制的4℃环境。所有样本均来自10名志愿者（5名男性和5名女性），每个采样点每人提供一份样本。10份第0天的新鲜样本作为两组样本共用的基准样本（并未分别为两种储存条件单独准备）；随后每种储存条件下，每个储存时间点再各有10份样本（每位志愿者一份）。因此，样本集1的样本总数为130份（10份共用的第0天样本 + 6个储存时间点×2种储存条件×10份/条件）。样本集2包含108份样本，对应6个时间点（以第1天作为阳性对照，另外还有1个月、6个月、12个月、24个月和36个月这几个时间点）。样本的基质为FTA卡片、纱布和棉签，样本在实验室中于室温（约25℃）下风干。每个时间点每种基质下各有6份样本，这些样本来自6名志愿者（2名男性和4名女性）。此外，还准备了6份验证样本（编号为T1–T6），来自6名志愿者（3名男性和3名女性），其时间点分别为1周、1个月、2个月、6个月、1年和2年。这些样本的基质为血液卡，同样在室温下风干。不同基质中所含的血液量有所不同：每张FTA卡片含有150微升血液，每支棉签含有50微升血液，每块纱布垫含有100微升血液。在满足相应储存条件后，所有样本都被储存在-80℃环境中以备后续使用。所有志愿者的年龄均在18至45岁之间，且均已签署知情同意书。该研究方案已获得公安部物证鉴定科学研究所伦理委员会的批准（批准编号为2023-002）。动物样本：共使用了11份动物样本，用于验证标记物和引物的物种特异性，其中包括9份肌肉组织样本（牛、马、驴、猪、山羊、绵羊、兔子、鸡、鸭）以及2份唾液拭子样本（狗、猫）。关于样本使用情况的详细信息见图1。下载：下载高分辨率图片（353KB）下载：下载完整尺寸图片图1. 样本分组和实验设计流程图。这255份样本包括244份人类血迹样本（样本集1，n=130；样本集2，n=108；以及6份独立验证样本T1–T6），以及11份用于检测引物物种特异性的动物样本。样本集1和样本集2在基质、储存时长和环境条件上有所不同，分别用于标记物筛选、相关性分析以及血迹形成时间模型的构建。模型的准确性则通过那6份验证样本进行评估。2.3 引物设计根据先前发表的论文[7]、[8]、[25]、[26]、[27]、[28]，我们选出了6个候选核酸分子标记物，其中包括4个物种特异性标记物（COX1、CYTB、16S rRNA和28S rRNA）[25]、[26]、[27]，以及2个常被用作参考基因、同时也可用于估算血迹形成时间的标记物（ACTB和18S rRNA）[5]、[6]、[28]。随后通过系统的稳定性评估，验证了这些标记物在当前实验条件下的标准化适用性（详见3.2节）。这6个标记物的参考序列均从NCBI Gene数据库中获取。COX1、CYTB和16S rRNA属于线粒体标记物；由于线粒体基因没有内含子，因此使用相同的引物对即可同时扩增基因组DNA和cDNA，且不会产生不同大小的产物。针对每个标记物，我们使用NCBI Primer-BLAST工具设计了6对引物（由中国桑根生物技术公司合成），用于扩增6个不同长度范围的片段（40–60、100–150、300–400、400–500、500–600和600–700碱基对），这些引物对依次被标记为a–f，每个长度范围大约会评估5对候选引物。所有候选引物都通过NCBI Primer-BLAST工具与目标物种的核基因组和线粒体基因组进行了比对，以确保它们只与预期的线粒体区域匹配，且不会与核基因组的线粒体假基因发生显著互补，从而最大限度地降低非目标扩增的风险。用于mRNA标记物ACTB的引物被设计为跨越外显子间连接处，而其他标记物的引物则无需如此设计。2.4. 核酸分离与定量根据制造商的说明，使用PureLink? Genomic DNA Mini Kit（Invitrogen，美国）提取总基因组DNA；该试剂盒的流程包括用RNase A处理步骤以分解共纯化的RNA，从而获得纯化的DNA。根据样品类型，将样品切割成不同大小：血液卡为5×3毫米，纱布为5×5毫米，拭子为3×3毫米。总RNA的提取则使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，德国），并结合无RNase的DNase Set（Qiagen，德国）进行柱上DNase I消化，进一步去除共纯化的基因组DNA，具体操作遵循制造商的指导。对于RNA提取，血液卡的样品大小为1×1厘米，纱布也为1×1厘米，拭子则为其一半大小。提取出的总DNA和RNA分别储存在-20℃和-80℃下，等待进一步处理。总DNA和RNA的浓度分别使用Qubit 4.0荧光计（Thermo Fisher，美国）以及相应的Qubit dsDNA HS测定试剂盒和Qubit RNA HS测定试剂盒，按照制造商的指示进行测定。RNA的完整性通过基于Cq值的扩增子长度检测法来评估（即同一标记物的RER检测，见2.8节），该方法通过比较同一分子的长扩增子与短扩增子的扩增情况，被MIQE指南视为替代RIN/RQI指标来反映RNA完整性的方法[24]。由于本研究分析的是随时间降解的RNA，且降解程度是实验的观测终点，因此未额外测定Bioanalyzer检测所得的RIN值。2.5. cDNA合成所有的逆转录反应均按照制造商的指示，使用ProtoScript? II First Strand cDNA Synthesis Kit（NEB，美国）进行。每个20微升的逆转录反应体系中包含10纳克的总RNA、2微升的随机引物混合物、10微升的ProtoScript II反应混合物（2倍浓度）、2微升的ProtoScript II酶混合物（2倍浓度），以及无RNase的水（TaKaRa，日本）。反应在Mastercycler? pro S（Eppendorf，德国汉堡）上进行，具体循环条件为：25℃下反应5分钟，42℃下反应1小时，80℃下反应5分钟，最后在4℃下保持。为了检测可能的基因组DNA污染，还设置了不含逆转录酶的阴性对照组。所有阴性对照组均未检测到扩增信号，这表明RNA样本中不存在可检测水平的基因组DNA污染，因此RT阳性反应中的信号可明确归因于RNA模板。逆转录反应产物被储存在-20℃下，等待进一步分析。2.6. 实时定量PCR实时定量PCR实验使用QuantStudioTM 7 Flex实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）以及Power SYBR Green PCR Master Mix（Life Technologies，美国）进行，操作遵循制造商的指导。每个10微升的反应体系中包含5微升的Power SYBR Green PCR Master Mix（2倍浓度）、0.25微升的正向引物（10微摩尔浓度）、0.25微升的反向引物（10微摩尔浓度）、4微升的无RNase水，以及0.5微升的cDNA产物。实时PCR的反应条件为：首先在95℃下反应10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95℃下反应15秒、60℃下反应1分钟，之后再进行熔解曲线分析，熔解曲线的分析条件为95℃下反应15秒、60℃下反应1分钟，接着是95℃下反应30秒、60℃下反应15秒。为了确保每次检测的重复性，每个样本都进行两次检测。所有检测的变异系数均低于5%，这说明实验具有良好的重复性。数据收集使用HID Real-Time PCR Analysis Software v1.3软件。若Cq值大于35，则被视为存在非特异性扩增现象[29]。如果Cq值显示为“无法确定”，则在后续分析中将其统一设为40[30]。此外，还使用无核酸酶的水作为模板设置了qPCR阴性对照组。在所有实验中，无模板对照组均未产生扩增曲线，也没有对应的Cq值（记录为“无法确定”），这证实了在所使用的SYBR Green检测体系下不存在引物二聚体信号或试剂污染问题。2.7. 引物筛选LinRegPCR分析：使用LinRegPCR 11.0版本软件分析了样本集1中三个新鲜血液卡样本的qPCR数据，旨在筛选出扩增效率在90%至110%之间的引物[31]、[32]。人类特异性验证：通过对动物样本中的COX1、CYTB、16S rRNA和28S rRNA进行qPCR检测，并结合Barcode of Life数据库及Mega 7.0软件分析，筛选出高度人类特异性的标记物和引物[8]。标准曲线构建：对于上述筛选出的标记物和引物，将其对应的质粒（来自中国Sangon Biotech公司）在无核酸酶水中依次稀释10倍，然后进行qPCR分析以构建标准曲线。之后通过这些数据计算引物的扩增效率及R2值，进而确定最终的引物候选名单。此外，构建好的标准曲线还可用于核酸分子的绝对定量分析。对于每项检测，都会将Cq值与模板拷贝数的以10为底的对数值建立回归关系，从而得到标准曲线：Cq=k?lgX0+b，其中X0表示每轮反应中的模板拷贝数，k为斜率，b为y轴截距；扩增效率则通过公式E=10?1k?1来计算。每个未知样本的模板拷贝数可通过插值法得出，公式为X0=10Cq?bk，该数值始终以每轮反应中的拷贝数形式呈现。根据MIQE指南[24]，检测限定义为能够检测到的最低模板拷贝数（以每轮反应中的拷贝数计）。2.8. 数据分析为评估核酸标记物的稳定性，共采用了五种方法：geNorm [33]、NormFinder [34]、BestKeeper [35]、ΔCq [36]以及RefFinder [37]。同时计算了四项定量指标：•不同标记物的RER比值 = Cq（目标基因）/ Cq（内部参考基因）•相同标记物的RER比值 = Cq（中等或长片段）/ Cq（短片段）•不同标记物的RE比值（ΔCq） = Cq（目标基因）— Cq（内部参考基因）•相同标记物的RE比值（ΔCq） = Cq（中等或长片段）— Cq（短片段）数据分析工作使用SPSS 22.0、Microsoft Excel 2021以及Graphpad Prism 10.0软件完成。在开展相关性分析之前，首先通过Shapiro–Wilk检验判断数据的正态性，结果显示数据并不遵循正态分布（p < 0.05）。因此，采用Spearman等级相关分析法来评估核酸降解指标与血迹留存时间TsD之间的关联。这种非参数统计方法不需要假设数据呈正态分布，能够有效捕捉单调关系，且对异常值具有较强抵抗力。为量化并排序外部因素和内部因素对核酸降解的影响，由于两组样本中存在的变量不同，因此分别对每组样本进行了多元线性回归分析。在每个模型中，因变量均为降解指数（即特定标记物-片段组合的RER值），而自变量则是在单个样本层面上同时引入的（强制进入法）。对于样本集1而言，该组仅使用了棉签这一种采样材料，并设置了两种储存温度，因此自变量包括储存时间（连续型，以月为单位）、温度（0代表4℃，1代表25℃）以及性别（0代表女性，1代表男性）。由于储存时间和温度被共同作为模型变量，所以储存时间为10天的新鲜样本被视作两种温度条件下的共同基准点t = 0；因此样本集1的回归分析是基于140个观测值进行的（每种温度条件下各有70个观测值，其中包括60个储存样本以及10个作为共同基准的当天采集的样本），这一设计与3.2节中关于目标基因和内部控制基因短片段稳定性对比分析、3.3节中关于四种核酸定量指标与血迹TsD之间相关性分析所描述的设计一致。对于样本集2而言，该组共有108个样本，仅设置了一种储存温度（约25℃），且未记录性别信息，因此自变量为储存时间（连续型，以月为单位）以及采样材料；采样材料为一个三水平的名义变量，因此以血液（FTA）卡作为参照类别，将其余的棉签与血液卡、纱布与血液卡分别转化为两个虚拟变量。对于每一组标记物-片段组合，都基于相同标记物的RER比值建立了单独的回归模型；对于RNA标记物，还会基于对应的不同标记物的RER比值（以ACTB为基准，长度为112bp）建立另一个回归模型，而DNA标记物则仅基于相同标记物的RER比值建立回归模型。各因素的相对重要性可通过其标准化回归系数的绝对值来判定，|β|值越大，表示该因素的影响越强；在样本集2中，三水平分类的采样材料因素则通过其两个虚拟对比组的标准化系数来体现。由于样本集1的设计是完全平衡的（由于存在共同的当天采集的基准样本，因此不同温度、性别和时间点的样本数量相当），各个自变量之间彼此独立，所以每个标准化系数几乎不会受到其他变量以及变量输入顺序的影响。为估算血迹留存时间TsD，共构建了四种曲线拟合模型：线性模型、反比模型、S形模型以及指数衰减模型，其中TsD为因变量，降解指标为自变量。模型性能通过R2值和MAPE值（平均绝对百分比误差）来评估，MAPE值越低，说明模型的预测精度越高。MAPE的计算公式如下：MAPE=1n∑i=1nyi?y?iyi×100%，其中n为样本总数；yi为第i个样本的实际血迹留存时间值；y?i为基于拟合模型得出的相应预测值；竖线符号则表示绝对值。MAPE值越低，说明模型的预测精度越高。3. 结果3.1. 标记物与引物的筛选通过文献综述，本研究初步确定了六种潜在的核酸标记物：COX1、CYTB、16S rRNA、28S rRNA、ACTB和18S rRNA。针对每种标记物，分别设计了六组引物，这些引物覆盖了六个不同的产物长度范围：40–60bp、100–150bp、300–400bp、400–500bp、500–600bp以及600–700bp，每个长度范围内大约有五种引物。为筛选出高质量的标准物和引物，首先使用LinRegPCR软件分析了样本集1中三个新鲜血液卡样本的qPCR扩增曲线，以此筛选出扩增效率处于标准范围（90%–110%）内的引物。分析结果表明，那些针对较短片段（40–60bp、100–150bp以及300–400bp）的引物符合要求，而针对长度超过400bp的片段的引物则大多不符合这一标准（详见补充材料1）。因此，后续实验选择了前三个长度范围的引物进行进一步研究。在人类特异性验证阶段，通过对人类样本以及11种动物样本的qPCR检测和生物信息学分析，确定COX1和16S rRNA属于高度人类特异性的标记物（详见补充材料2）；针对这两个标记物的所有三种片段长度设计的引物均未出现交叉反应。对于最终选定的四种标记物（COX1、16S rRNA、ACTB、18S rRNA），其对应的质粒（来自中国Sangon Biotech公司）被依次稀释10倍，用于构建标准曲线。经过验证，最终确定了四组最优的引物组合，每组对应三种片段长度：COX1的引物长度分别为44bp、134bp和303bp，16S rRNA的引物长度分别为56bp、150bp和331bp，ACTB的引物长度分别为60bp、112bp和344bp，18S rRNA的引物长度分别为45bp、145bp和302bp（见图2以及补充材料3、4）。所建立的qPCR检测方法能够可靠地检测到每轮反应中至少20个拷贝的模板，这一最低稀释度也通过了验证，说明该方法非常适合用于微量法医样本的分析（详见补充材料3）。下载：下载高分辨率图像（195KB）下载：下载全尺寸图像图2. 四种标记物的扩增产物图像（COX1、16S rRNA、ACTB、18S rRNA）。图中显示了扩增片段的位置以及引物序列的编号。S表示短片段，M表示中等长度片段，L表示长片段。3.2. 目标基因与内部控制基因短片段稳定性的对比分析为验证目标基因的短片段是否具有与内部参考基因相当的稳定性，同时确定最适合用于估算血迹留存时间TsD的核酸定量方法，本研究共采用了五种方法来评估参考基因的稳定性：geNorm [33]、NormFinder [34]、BestKeeper [35]、ΔCq方法[36]以及RefFinder [37]在线分析工具。从样本集1中的70份血迹样本中提取了RNA，这些样本包括60份在25℃条件下储存的样本，储存时间分别为1天、3天、1周、2周、1个月和2个月，另外还有10份新鲜样本。通过这些样本，对比了四种目标基因（COX1、16S rRNA、ACTB、18S rRNA）的短片段（40–60bp）与两种参考基因（ACTB、18S rRNA）的中等长度片段（100–300bp）的稳定性。为简化表述，此处将这类中等长度片段简称为“内部参考基因”。在所有五种分析方法中，都呈现出一致的总体趋势：目标基因的短片段（40–60bp）的稳定性通常与传统的内部参考基因ACTB（112bp）和18S rRNA（145bp）相当，甚至更为稳定。在各项分析中，16S rRNA短片段（56 bp）是最稳定的标记物，而18S rRNA（145 bp）则始终最不稳定；值得注意的是，每种传统参考基因的稳定性都低于其对应的短片段（见图3）。下载：下载高分辨率图像（514KB）下载：下载全尺寸图像图3. 目标基因短片段与参考基因的稳定性评估结果。geNorm：M值越小表示基因稳定性越高，反之则越低。当M<1.5时，该基因可视为相对稳定。BestKeeper：标准差越小表示基因稳定性越高，阈值为1；若SD>1，则该基因不稳定。Normfinder：稳定性数值越低表示基因稳定性越高。ΔCq方法：平均标准差越小表示基因表达越稳定。RefFinder：该网站通过四种算法进行综合稳定性评估，从而弥补单一算法分析的不足。这五种工具在排名极值上的结论较为一致：在所有分析中，16S rRNA（56 bp）和ACTB（60 bp）的排名均高于两种传统参考基因，而18S rRNA（145 bp）的排名最低。它们在COX1短片段（44 bp）与ACTB参考基因（112 bp）的相对排名上存在差异。geNorm和BestKeeper将包括COX1（44 bp）在内的所有四个短片段的稳定性都置于参考基因之上，而NormFinder和ΔCq方法则认为ACTB（112 bp）的稳定性略高于COX1（44 bp）和18S rRNA（45 bp）。RefFinder通过整合其他四种算法得出的排名显示，16S rRNA（56 bp）、ACTB（60 bp）和18S rRNA（45 bp）的稳定性均高于传统参考基因，其中16S rRNA（56 bp）的整体排名最高。总体而言，这些结果表明，目标基因的短片段，尤其是16S rRNA（56 bp），其数据标准化稳定性至少可与传统参考基因相媲美，因此适合作为同标记RER策略中的内部参考基因。这些算法基于不同的统计原理（geNorm和BestKeeper基于成对/标准差变异，NormFinder基于模型化的方差估计，ΔCq方法基于平均成对ΔCq值），因此在排名相近的片段上出现细微差异是正常的，而RefFinder的综合排名可作为最佳判定依据。3.3. 四种核酸定量指标与血迹年龄推断值之间的相关性分析为了比较由两种标记策略（同标记和不同标记）结合两种计算方式（基于比值的RER法和基于ΔCq的RE法）所得到的四种核酸定量指标，进而确定最适合用于血迹年龄推断的方法，本研究使用了来自样本集1的70份血迹样本，其中包括60份在25℃下保存了1天、3天、1周、2周、1个月和2个月的样本，以及10份新鲜样本。由于目前关于血迹年龄推断的研究主要聚焦于RNA分子，因此从这70份样本中提取了RNA，并选择了四种RNA靶标（COX1、16S rRNA、ACTB和18S rRNA）用于分析。ACTB和18S rRNA是常用的内部参考基因；根据前述稳定性评估结果，ACTB（112 bp）的稳定性高于18S rRNA（145 bp），因此被选为内部参考基因。研究通过斯皮尔曼相关分析，来评估这四种定量指标所得结果与血迹年龄推断值之间的相关性（见表1）。结果显示，同一标记方法所得指标之间的相关性通常高于不同标记方法所得指标之间的相关性。在相同标记方法的指标中，RER法得到的绝对相关系数最高（0.458–0.849）。对于同一标记的不同片段，RER法与年龄推断值的相关性通常强于RE法。其中，16S rRNA-331 bp和ACTB-344 bp这两个相同标记的片段与年龄推断值的相关性最强（相关系数分别为0.801和0.849），表明这两类片段是用于年龄推断的最有潜力的指标。表1. 四种核酸定量指标的相关性分析结果——相关系数的绝对值。质量控制标记物计算方法COX116S rRNAACTB18S rRNA134 bp303 bp150 bp331 bp112 bp344 bp145 bp302 bp目标基因的短片段RE(△Cq)0.445??0.721??0.469??0.800??0.521??0.852??0.610??0.673??RER0.458??0.734??0.471??0.801??0.515??0.849??0.600??0.687??内部参考基因（ACTB(112 bp)）RE(△Cq)0.245?0.606??0.0870.770??-0.622??0.238?0.533??RER0.250?0.612??0.606??0.780??-0.601??0.389??0.569???. 相关性在0.05水平上显著（双尾检验）。??. 相关性在0.01水平上显著（双尾检验）。-. 不适用（用于标准化的参考基因与待评估基因相同）。3.4. 不同标记片段拷贝数与血迹年龄推断值之间的相关性上述分析表明，在四种定量指标中，同标记RER法是最适合用于血迹年龄推断的方法。为了为基于同标记RER法的血迹年龄推断模型提供数据，同时明确标记类型和片段长度对核酸稳定性的影响，我们分析了不同核酸标记的拷贝数与血迹年龄推断值之间的相关性。研究对在不同时间、温度和基质条件下处理的238份血迹样本进行了qPCR检测，检测了六种核酸标记（DNA：COX1、16S rRNA；RNA：COX1、16S rRNA、ACTB、18S rRNA），这些标记的片段长度分布在三个区间：40–60 bp、100–150 bp和300–400 bp。为提高分析精度，研究采用了绝对定量方法，后续分析使用的是拷贝数而非Cq值。随后通过斯皮尔曼相关分析来评估拷贝数与血迹年龄推断值之间的关系（见表2和表3）。表2. DNA样本的相关性分析结果——相关系数的绝对值。条件样本COX116S rRNA44 bp134 bp303 bp56 bp150 bp331 bp样本集1-4℃0.398??0.376??0.248?0.321??0.334??0.299?样本集1-25℃0.1500.1270.438??0.1630.307??0.250?样本集2-BC0.0670.473??0.830??0.2820.705??0.810??样本集2-CS0.368?.649??.856??.353?.651??.860??样本集2-G0.686??.791??.800??.727??.824??.822???. 相关性在0.05水平上显著（双尾检验）。??. 相关性在0.01水平上显著（双尾检验）。BC：血液卡；CS：棉签；G：纱布。表3-1. RNA样本的相关性分析结果——相关系数的绝对值。条件样本COX116S rRNA44 bp134 bp303 bp56 bp150 bp331 bp样本集1-4℃0.327??.2060.2310.2180.1560.127样本集1-25℃0.510??.634??.648??.509??.607??.776??样本集2-BC0.778??.943??.922??.936??.961??.983??样本集2-CS0.774??.836??.871??.955??.972??.975??样本集2-G0.833??.884??.894??.919??.959??.969???. 相关性在0.05水平上显著（双尾检验）。??. 相关性在0.01水平上显著（双尾检验）。BC：血液卡；CS：棉签；G：纱布。表3-2. RNA样本的相关性分析结果——相关系数的绝对值。条件样本ACTB18S rRNA60 bp112 bp344 bp45 bp145 bp302 bp样本集1-4℃0.1810.331??.301?.0980.0530.178样本集1-25℃0.256?.357??.588??.1650.444??.533??样本集2-BC0.727??.946??.947??.799??.946??.874??样本集2-CS0.880??.963??.963??.724??.968??.969??样本集2-G0.720??.932??.915??.637??.943??.957??就片段长度而言，同一标记的长片段（300–400 bp）与年龄推断值的相关性明显高于短片段（40–60 bp）。例如，在样本集2中（以纱布为基质），RNA COX1-303 bp片段的相关系数为0.894，而44 bp片段的相关系数仅为0.833。这说明长片段稳定性较差，更容易随时间降解。就核酸类型而言，RNA标记与年龄推断值的相关性通常强于DNA标记。例如，在样本集2中（以血液卡为基质），RNA 16S rRNA-331 bp片段的相关系数为0.983，远高于对应的DNA片段（0.810），这表明RNA的降解比DNA更受时间影响。不过也存在例外情况。在样本集1中（4℃保存），核酸片段与年龄推断值的相关性普遍较低，且短片段的表现甚至优于长片段。这可能是因为低温能够抑制降解作用；当整体降解程度很轻时，长片段在反映年龄方面的优势就会减弱，随机变异可能占据主导地位。3.5. 温度、基质、时间及性别对核酸降解指数（RER）影响的比较分析为了评估同标记法相较于不同标记法是否能减少由内在因素（如性别）带来的个体间差异，同时了解温度、基质、时间和性别对核酸降解的影响，我们进一步研究了这些因素如何影响血迹年龄推断模型，并试图找到构建更可靠模型的方法。研究使用了来自两个样本集的238份血迹样本的拷贝数数据，这些样本在不同温度、时间、基质和性别条件下采集，我们分别采用同标记RER法和不同标记RER法计算降解指数。对于DNA，仅使用了同标记RER法；而对于RNA，则两种方法都采用了。如2.8节所述，随后针对每个样本集分别进行多元线性回归分析，以标记降解指数（RER）作为因变量：样本集1的因变量为储存时间、温度和性别，而样本集2的因变量为储存时间和经过虚拟编码的基质类型。对于每一组标记/指数组合，都拟合了一个独立的多元线性回归模型。按照2.8节中的定义，不同标记RER指数（R1、R2）是以ACTB-112 bp作为内部参考进行标准化的，而同标记RER指数（S1、S2）则是以同一标记中最短的扩增片段（40–60 bp）作为标准化基准。由于每组标记/指数组合都对应一个独立的模型，因此图4展示了多个独立的回归模型。对于每个模型，均以标准化回归系数的绝对值（|β|）来衡量各影响因素的相对重要性，绝对值越大，说明该因素对相应RER值的影响越强。下载：下载高分辨率图像（507KB）下载：下载全尺寸图像图4. 影响核酸降解指数（RER）的各项因素的标准化回归系数（β）。图中分别展示了样本集1（自变量：储存时间、温度、性别；共140个观测值，即每个温度条件各有70个样本，其中10天和0天的新鲜样本在两个温度组中是共享的）和样本集2（自变量：储存时间和虚拟编码的基质类型，以血液卡作为参照；共108个样本）的模型情况。每根柱子代表某一标记-片段RER指数对应的某个因素的标准化系数，柱子的高度则反映了该因素影响的相对强度。同标记法：S（S1：中等片段/短片段；S2：长片段/短片段）。不同标记法：R（R1：中等片段/内部参考基因；R2：长片段/内部参考基因）。BC：血液卡；CS：棉签；G：纱布。R-：RNA；D-：DNA；16S：16S rRNA；18S：18S rRNA。?P < 0.05，??P < 0.01，???P < 0.001。如图4所示，在样本集1的同标记模型以及样本集2的DNA模型中，储存时间是影响降解程度的最主要外部因素。在样本集1中，12个同标记RER模型中有11个的时间因素具有显著性（P < 0.05），时间的标准化系数在0.27到0.49之间，其影响一致性高于不同标记模型，在不同标记模型中只有6个模型中的3个时间因素具有显著性（|β| ≤ 0.28）。在≤2个月的时间内，温度也有相当大的影响，在样本集1的大多数模型中都具有显著性（|β|最高可达0.60）。性别的影响总体最小；在同标记模型中，性别的标准化系数从未超过0.23，且在12个模型中只有4个具有显著性，而在不同标记模型中，性别的系数更大（最高可达0.40），在6个模型中也有4个具有显著性。这一对比直接证明了同标记RER法能够降低性别带来的个体间差异。在样本集2中，基质对DNA降解的影响大于对RNA降解的影响：对于DNA标记，时间因素依然起主导作用且具有显著性（|β|为0.43–0.62），而且在所有四个模型中，至少有一种基质对比（棉签或纱布与血液卡相比）具有显著性（|β|最高可达0.49）；而对于RNA标记，时间因素的影响较小且不显著（|β| ≤ 0.16），仅有4个模型中的1种基质对比具有显著性，这反映出在0–36个月的时间内，RNA的降解程度较高，且个体间差异较大。所有模型的完整标准化系数及显著性水平详见补充材料5。3.6. 血迹年龄推断模型的构建基于上述分析，同标记RER法被确定为最适合用于估算血迹年龄的核酸定量方法。针对不同的环境条件，研究利用曲线拟合方法（线性、倒数、S型和指数型），基于从6种标记——DNA中的COX1和16S rRNA，RNA中的COX1、16S rRNA、ACTB和18S rRNA——获得的两个RER值——S1（中等片段/短片段比值）和S2（长片段/短片段比值）——为本研究收集的238份血迹样本构建了初步的年龄推断模型。除了4℃下的样本集1外，其他所有条件都成功建立了具有统计学意义的模型。在经过初步筛选后（所有系数的R2均大于0.6且P值小于0.05），每种标记与条件组合中R2最高的曲线被保留下来（详见补充材料6）。随后，研究使用了在1周、1个月、2个月、6个月、1年和2年分别采集的6份验证样本（T1–T6），通过平均绝对百分比误差（MAPE）来评估这些模型的预测准确性。5. 讨论
本研究系统比较了四种基于qPCR的核酸定量指标在估算血迹形成时间方面的性能，分析了影响核酸稳定性的内在与外在因素，并基于244个人类血迹样本和11种动物样本建立了预测模型。在所评估的四种指标中，同标记相对表达比率方法与血迹形成时间的关联度最高，同时能有效降低个体差异（尤其是性别差异）带来的干扰。这些发现有助于解决现有基于qPCR的方法中一直未解的方法学问题，并为未来标准化基于qPCR的血迹形成时间推断提供了初步的实证依据，不过在提出标准化方案之前还需进行更广泛的验证。

从机制上来看，同标记相对表达比率方法以某种核酸分子的短片段作为参考，以同一分子的中等或长片段作为目标，所得比值可反映降解程度。这种方法具有两个概念上的优势：首先，它关注的是核酸质量的变化（降解动力学），而非数量变化（ΔCq），这与我们的观察结果一致——在血迹老化过程中，核酸质量的变化比绝对拷贝数更具时间依赖性。由于长片段比短片段更容易发生链断裂，因此来自同一分子的长片段的可扩增拷贝数下降速度更快。这样一来，长片段与短片段的比值变化比单一片段的绝对丰度变化更具时间依赖性和重复性，而后者还会受到初始模板量及个体差异的干扰。其次，由于参考序列和目标序列都来自同一个分子，两种不同基因因独立生理或病理因素导致的比值波动会被显著抑制，从而提高数据归一化的准确性和重复性。尽管此前已有研究者采用过这种方法，但其原理尚未得到实验验证。通过五种参考基因稳定性评估工具（geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCq方法和RefFinder），我们首次提供了实验证据，表明在所测试条件下，目标基因的短片段（如16S rRNA，56 bp）的表达稳定性可与传统参考基因ACTB相媲美，在当前数据集中甚至更优。这为短目标基因片段作为内部对照的功能提供了直接支持，意味着在使用同标记相对表达比率策略时无需额外的参考基因，从而简化了工作流程，避免了因选择不当的参考基因而产生的误差。

对内在因素（核酸类型和片段长度）的分析得出了三个重要结论：首先，对于同一序列而言，DNA标记比RNA标记更稳定；DNA COX1（134 bp）与血迹形成时间的关联度明显弱于对应的RNA目标序列。其次，对于同一标记而言，短片段始终比长片段更稳定，这一点从RNA COX1（44 bp）与时间的相关性远低于RNA COX1（134 bp）即可看出。第三，五种参考基因稳定性评估工具表明，在常用的100–150 bp范围内，ACTB的稳定性高于18S rRNA，这一结果与以往认为rRNA的稳定性普遍优于mRNA的观点相反。实际上，18S rRNA（145 bp）的拷贝数与时间的相关性更强，而ACTB（112 bp）的相关性则稍弱；相反，ACTB（344 bp）与时间的相关性又强于18S rRNA（302 bp）。一个合理的解释是，此处使用的18S rRNA扩增片段长度（145 bp）大于ACTB扩增片段长度（112 bp），因此长度带来的易切割性超过了核糖体蛋白复合物所提供的保护作用。这也为Simard等人[12]发现的、基于18S rRNA和ACTB mRNA的相对表达比率无法区分样本血迹形成时间的现象提供了简洁的解释。总体而言，这些研究结果表明，干燥血迹中的核酸稳定性受多种相互作用的因素影响，分子结构所带来的内在稳定性并非绝对，片段长度可能抵消核糖体复合物的自然保护作用。因此，片段长度成为决定核酸稳定性的关键内在因素，也为同标记相对表达比率策略提供了机制上的支持。进一步来说，这些结果也为基于DNA的血迹形成时间推断提供了依据：尽管有研究称DNA无法提供血迹形成时间的信息[3][6][12][13]，但我们的数据以及之前的研究[8]、Nakanishi等人的研究[39]和Cossette等人的研究[40]均表明，延长DNA扩增片段的长度可使基于DNA的血迹形成时间估算成为可能。

在外在因素方面，时间被证明是影响核酸稳定性的最主要因素，这一结果与法医学中时间推断的目标高度契合。温度相关的影响可通过构建特定温度下的模型来处理；在基于RNA的模型中，基底材料的影响较为轻微，几乎不具备统计显著性，可通过合理选择标记来进一步控制；性别的影响也很小（系数<0.23），并且通过同标记相对表达比率方法可进一步降低其影响，这一结论与以往的研究结果一致[7][13]。由于时间是最主要的影响因素，而其他因素要么可以控制，要么可以忽略，因此该框架在案件分析中易于使用：一旦知道存储温度和基底材料类型，调查人员就可以直接选择相应的模型。在本研究中，样本在4 ℃和25 ℃下存储的时间最长为两个月。在25 ℃下，标记序列的拷贝数与时间呈强相关性，有助于构建稳定的模型，这一结果与Anderson等人的研究[6][13]一致；而在4 ℃下，相关性普遍较弱，无法构建具有统计意义的模型，这一结果与Heneghan等人的研究[23]一致。我们的研究结果与Zhang等人的研究[14]有所不同，他们成功构建了4 ℃下的模型；最合理的解释是他们的采样时间长达196天，远远超过我们的采样时间，因此在低温存储条件下能够更完整地呈现时间相关的降解规律。本研究中使用的三种基底材料（血卡、棉签和纱布）是法医案件中最常用的基底材料[5][16][19][39][40][41][42]，但目前针对特定基底材料的模型却很少见。虽然这些基底材料是标准的采样材料，而非犯罪现场实际出现的基底材料，但本研究开发的特定基底材料模型为解决基底材料带来的差异问题提供了初步参考，也为实际案件应用奠定了基础。

基于这些分析，我们利用同标记相对表达比率指标构建了按时间范围、温度和基底材料分层的血迹形成时间估算模型，并使用决定系数（R2）和平均绝对百分比误差（MAPE）在独立测试集上对这些模型进行了评估。最终保留了八种性能较好的模型，这些模型涵盖了短期（最多2个月）和长期（最多3年）的时间段，从而弥补了早期研究时间覆盖范围较窄的缺陷。此外，最终模型中保留的COX1和16S rRNA标记具有高度的人类特异性，能够有效排除牛、马、狗和猫等11种常见动物物种的干扰。由于犯罪现场的血迹往往与动物血液一同存在，因此物种鉴别对于避免证据误判至关重要。以往的大多数研究都忽视了物种特异性问题；通过将人类特异性纳入标记选择标准，本研究显著提升了估算结果的法医可靠性。

与本研究同时，Nakanishi等人[42]也提出了一种基于同一分子RNA降解比率的策略，用于估算血迹形成后的时间，这一研究进一步支持了这样一个观点：来自同一标记的长片段与短片段的比值比绝对丰度更能作为可靠的时间指示器。我们的研究结果与他们的研究一致，都证实了降解比率原理的有效性，但在方法学层面存在一些差异。首先，Nakanishi等人仅研究了一种降解比率测定方法，而据我们所知，本研究是首次对文献中描述的四种基于qPCR的定量指标进行系统的直接比较，为同标记相对表达比率方法能够同时最大化与血迹形成时间的相关性并降低性别相关表达差异提供了直接的实验证据。其次，我们通过五种互补的参考基因稳定性评估工具（geNorm、NormFinder、BestKeeper、比较ΔCq方法和RefFinder），证明了目标基因的短片段本身也具有与传统内部对照基因如ACTB相当甚至更高的表达稳定性。这一发现意味着在采用同标记相对表达比率设计时无需额外的参考基因。第三，以往的降解比率研究通常只评估有限的条件，而本研究则开发出了针对人类特性的预测模型，这些模型已在11种常见动物物种上进行了验证，且覆盖了多个时间区间（最多3年）、两种存储温度以及三种法医标准基底材料（血卡、棉签和纱布）。总体而言，我们的结果既是对Nakanishi等人[42]提出的降解比率框架的补充，也对其进行了实质性扩展，使其更接近法医实际应用。

需要进一步强调的是，本研究中涉及的三种基底材料（FTA/血卡、棉签和纱布）都是标准的法医采集和存储材料，而非那些真实案件中血迹最常见的沉积和老化环境中的表面材料（如纺织品、木材、混凝土或土壤）。尤其是FTA卡片，其化学成分经过特殊设计，可用于裂解细胞、抑制核酸酶活性并稳定核酸，以便在常温下存储；因此，不能将其降解行为直接等同于在不受控制的表面上、在湿度变化、微生物滋生和阳光照射条件下老化的血迹的降解行为。尽管在本研究中的三种基底材料上仍能清晰观察到随时间变化的降解现象，但这些模型是基于在受控条件下实验室老化的样本建立的，其在实际环境中的适用性和可直接应用于真实案件血迹的能力仍有待验证。在这些模型能够应用于实际案件之前，还需要在真实的法医相关环境中对各种表面的真实血迹进行前瞻性验证，这也是我们未来工作的重点。此外，我们需要指出，这些预测模型是在标准采样基底材料和非极端存储条件下，针对六个独立样本（T1–T6）进行验证的，且均为单标记模型。因此，目前的发现应被视为支持同标记相对表达比率方法的概念性证据，而非可用于实际案件的成熟标准；要实现更广泛的方法学应用，还需要更大规模的独立样本群、真实的案件样本、极端环境条件以及多标记组合分析（例如结合RNA和DNA标记），以充分利用不同分子的互补降解特性，进一步提升模型的稳定性，从而实现更精确、更广泛的应用。结论本研究比较了四种基于qPCR的核酸定量指标，用于估算血迹沉积时间。研究使用了11个动物样本来验证引物的物种特异性，以及244个人类血迹样本（238个用于模型构建，6个用于独立验证），这些样本是在不同温度、储存时间、基底条件下采集的，且涵盖不同性别。共筛选了四种标记物，每种都有三种片段长度；COX1和16S rRNA被确认为仅存在于人类体内。在所研究的条件下，目标标记物的短片段表现出与常规内参基因相当的表达稳定性，可用于数据标准化，据我们所知，这是首次为这一假设提供实验依据。这些结论基于有限的独立验证数据集，需要在更大规模、更多样化的样本集中进一步验证。在四种定量指标中，同一标记物的RER方法最能准确反映核酸随时间的降解情况，且能降低个体间的表达差异。在所考察的因素中（标记物类型、片段长度、储存时间、温度、基底和性别），储存时间是影响最大的外部因素。在此基础上，针对不同的样本集和储存条件建立了血迹沉积时间估算模型；在6个独立验证样本上，所有模型的平均绝对百分比误差均低于30%（T1–T6，储存时间为1周至2年），其中R-18S-S1模型在样本集2中的棉签（R2 = 0.978，MAPE = 13.99%）和纱布（R2 = 0.931，MAPE = 11.18%）样本上的表现最佳。这些结果为基于qPCR的法医血迹沉积时间估算提供了方法学参考。

CRediT作者贡献说明：王哲：研究、正式分析、数据整理。李阳：验证、数据整理。孙启帆：写作–审阅与编辑、资源获取、方法论、资金筹集、概念设计。赵东：监督、方法论、资金筹集、概念设计。莫晓婷：写作–审阅与编辑、验证、研究。何红霞：写作–审阅与编辑、原始稿撰写、可视化、验证、方法论、研究、正式分析、数据整理、概念设计。周哲：监督、方法论、研究、概念设计。