迁移体相关基因与长链非编码RNA在胶质瘤中的关联及其对肿瘤微环境的预后意义

《IBRO Neuroscience Reports》：Associations Between Migrasome-Related Genes and Long Non-Coding RNAs in Glioma and Their Prognostic Relevance to the Tumor Microenvironment

　　

本研究旨在探索迁移体（migrasome）相关基因与长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）在胶质瘤中的关联，并评估迁移体相关lncRNA模式是否与胶质瘤预后及肿瘤微环境相关。研究人员从TCGA GDC数据库获取转录组、临床、生存及突变数据。迁移体相关基因来源于已发表文献和GeneCards数据库，采用|cor| > 0.4且P < 0.05筛选共表达lncRNA。将674例具有完整生存信息的胶质瘤病例随机分为训练队列和内部验证队列（1:1，各337例），采用单因素Cox回归、十折交叉验证的LASSO Cox回归及多因素Cox回归构建八lncRNA风险模型。外部队列CGGA325、CGGA693和GSE16011用于评估模型基因覆盖度。由于这些平台仅覆盖部分八lncRNA标志物，研究人员在进行队列内z-score标准化后，开展可用基因的外部生存分析和可用基因部分评分分析。免疫浸润、肿瘤微环境评分、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）、TIDE评分及预测药物敏感性作为探索性相关因素进行分析。

结果显示，八lncRNA风险评分与训练队列、内部验证队列及总体TCGA队列的总生存期相关（P < 0.001）。在总体TCGA队列中，风险评分的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.880。由于CGGA325覆盖3个模型lncRNA（CRNDE、AC007879.2和LINC00092），CGGA693覆盖2个（CRNDE和LINC00092），GSE16011仅覆盖CRNDE，因此无法进行完整的外部验证。可用基因部分评分在CGGA325（n = 313，HR = 1.54，95% CI: 1.37-1.74，P = 4.78 × 10^-13）、CGGA693（n = 657，HR = 1.34，95% CI: 1.27-1.42，P = 8.98 × 10^-25）和GSE16011（仅CRNDE；n = 240，HR = 1.43，95% CI: 1.25-1.64，P = 3.85 × 10^-7）中仍与总生存期相关。高风险肿瘤表现出更高的基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分及增加的巨噬细胞浸润，包括M2型巨噬细胞。较高TMB与更差的生存相关，预测药物反应分析提示了需进一步验证的候选化合物。

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占该类肿瘤的80%，且具有高度异质性。根据最新WHO指南，胶质瘤分为五大类，其中以成人型弥漫性胶质瘤最为常见。胶质瘤的发病率存在地域和人群差异，欧洲和美国显著高于亚洲。胶质瘤按恶性程度分为Ⅰ-Ⅳ级，高级别胶质瘤（Ⅲ-Ⅳ级）总生存期仅约1.5-3年，而低级别胶质瘤患者生存期可超过十年。迁移体是近年新发现的细胞器，于迁移细胞尾端产生收缩纤维，并在纤维连接处或顶端形成囊泡，其功能与细胞迁移密切相关。细胞迁移对血管生成、伤口愈合、免疫应答及癌细胞侵袭转移至关重要。研究显示，迁移体产生在高迁移性胶质瘤中增加，有助于癌细胞存活；动物模型中迁移体增加与胶质瘤增殖、侵袭和转移能力增强相关。然而，迁移体与胶质瘤的具体机制尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸的RNA分子，主要调控基因和蛋白表达，具有显著的组织特异性表达特点。lncRNA广泛参与肿瘤增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成等多种病理过程，在胶质瘤中同样发挥重要作用。目前已有大量lncRNA被证实促进胶质瘤迁移侵袭、血管生成及抗凋亡。尽管迁移体生物学和lncRNA调控可能共同汇聚于胶质瘤的细胞迁移、侵袭和肿瘤微环境重塑，但两者之间的直接分子相互作用尚未建立。因此，本研究旨在作为探索性生物信息学分析，识别与迁移体相关基因共表达的lncRNA，并评估其在胶质瘤中的预后关联。研究人员利用TCGA转录组和临床数据构建并内部验证八lncRNA风险模型，进而分析免疫浸润、TMB、预测免疫治疗反应和药物敏感性相关因素，以产生可检验的假设而非证明因果关系或即时临床效用。

研究数据来源于TCGA GDC数据库，包含674例具有完整生存信息的胶质瘤肿瘤样本及5例邻近正常样本，表达数据以每百万转录本（transcripts per million, TPM）格式提取。迁移体相关基因从已发表文献和GeneCards数据库获取，去除重复后得到11个独特基因。通过|cor| > 0.4且P < 0.05的共表达分析筛选出656个迁移体相关候选lncRNA。将674例病例随机分为训练队列和内部验证队列（各337例），经单因素Cox回归后，将符合条件的危险因素纳入LASSO Cox分析，经十折交叉验证选择lambda.1se值构建模型，最终多因素Cox模型生成风险评分公式。风险评分 = (CRNDE × 0.26) + (AL390755.1 × 0.32) + (AC007879.2 × 0.52) + (AL354919.2 × 0.21) + (POLR2J4 × 0.52) + (AL691432.4 × -0.43) + (LINC00092 × 0.25) + (AL138479.2 × -0.36)。以训练队列中位风险评分作为截断值，应用于内部验证队列和总体TCGA队列。外部可转移性评估采用CGGA325、CGGA693和GSE16011三个独立数据集，由于各平台仅覆盖部分模型lncRNA，研究人员进行了可用基因的z-score标准化部分评分分析。

主要技术方法包括：从TCGA GDC数据库获取转录组、临床、生存和突变数据；通过Pearson相关性分析筛选与迁移体相关基因共表达的lncRNA；采用LASSO Cox回归结合十折交叉验证构建预后模型，并进行内部和外部验证；使用CIBERSORT算法估计22种免疫细胞类型分布；采用ESTIMATE算法评估肿瘤微环境评分；通过TIDE数据库预测免疫治疗反应；利用oncoPredict包基于GDSC2参考数据预测药物敏感性；进行GO、KEGG和GSEA富集分析；开展泛癌生存分析和临床特征关联分析。

研究结果部分，"共表达lncRNA与迁移体相关基因的筛选及预后模型构建"显示，从12个迁移体相关基因条目中筛选出11个独特基因，共表达分析识别656个迁移体相关候选lncRNA。经LASSO Cox回归确定八lncRNA预后模型，热图显示多数模型lncRNA与迁移体相关基因存在统计学显著相关性，而PKD1与多数模型lncRNA无关联。Kaplan-Meier生存分析显示总体队列中高风险组320例、低风险组354例，高风险患者生存概率显著降低（P < 0.001），训练队列和内部验证队列结果一致，总体队列无进展生存分析亦显示相同趋势。模型lncRNA表达模式与系数方向总体一致：CRNDE、AL390755.1、AC007879.2、AL354919.2、POLR2J4和LINC00092在高风险肿瘤中相对高表达，AL691432.4和AL138479.2则相对低表达。

"模型评估与亚组生存分析"部分，多因素Cox回归显示年龄、WHO分级和风险评分与总体生存期独立相关。内部ROC分析中风险模型AUC为0.880，高于WHO分级的0.838；时间依赖性ROC分析显示3年时AUC最高达0.932。预后列线图和校准曲线提示风险模型在1年、3年和5年具有预测价值，C指数分析显示风险模型评分高于评估的临床特征。亚组分析表明高风险患者在各年龄组、男性和女性中均显示降低的生存概率。外部验证方面，CGGA325的可用基因部分评分（CRNDE、AC007879.2、LINC00092）与更差总生存期相关（n=313，HR=1.54）；CGGA693的部分评分（CRNDE、LINC00092）亦相关（n=657，HR=1.34）；GSE16011仅CRNDE可用，仍与不良预后相关（n=240，HR=1.43）。WHO分级亚组分析显示低级别胶质瘤中高风险组生存显著降低，TR5>但高级别胶质瘤中无显著差异，可能与高分级组中低风险患者仅4例、样本量不足有关。

"基因分型评估及差异表达基因富集分析"部分，主成分分析（PCA）显示基于风险lncRNA的分类能最清晰区分高风险和低风险患者。差异表达分析获得3852个差异表达基因，KEGG分析提示主要涉及ECM-受体相互作用、系统性红斑狼疮、吞噬体、利什曼病和尼古丁成瘾等通路；GO分析显示生物学过程包括白细胞介导的免疫和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织，细胞成分涉及含胶原ECM、突触膜和质膜外侧，分子功能涉及ECM结构成分、抗原结合、胶原结合和生长因子结合。GSEA分析显示低风险组主要富集心肌收缩、缝隙连接和长时程抑制通路，高风险组则富集补体和凝血级联、细胞因子-细胞因子受体相互作用和ECM-受体相互作用通路。

"肿瘤微环境与免疫细胞及功能富集分析"部分，CIBERSORT分析估计高风险组M0、M1和M2型巨噬细胞比例较高，而单核细胞和静息NK细胞较低。肿瘤微环境评分显示高风险组基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分均高于低风险组。免疫功能分析显示除细胞溶解活性和肥大细胞外，其余评估功能在两组间均有统计学差异，高风险组估计评分更高。

"肿瘤突变负荷与免疫治疗分析"部分，高风险组TTN、MUC16、FLG和DNAH5突变更为普遍，而TP53和ARID1A突变较少。小提琴图显示高风险组TMB更高。生存分析显示高TMB患者生存期更短，中位生存期高TMB组1.7年、低TMB组8年。联合风险评分和TMB分析显示高风险/高TMB组生存概率最低，低风险/低TMB组最佳。TIDE评分分析显示高风险和低风险组间预测免疫治疗反应无显著差异，但该结果需谨慎解读，因TIDE并非针对胶质瘤开发。oncoPredict预测的药物敏感性分析识别了需进一步验证的候选化合物。

"泛癌生存分析与模型基因临床特征分析"部分，CRNDE在肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma, ACC）和脑低级别胶质瘤（low-grade glioma, LGG）中与高风险相关；AL390755.1在LGG中与高风险相关；AC007879.2在LGG、多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）和胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma, PAAD）中与高风险相关；AL354919.2在LGG中高风险、在葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UVM）中低风险；POLR2J4在LGG和UVM中均与高风险相关；AL691432.4在胶质瘤中保护性但在皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma, SKCM）中高风险；LINC00092在LGG中高风险；AL138479.2在LGG中保护性。临床特征分析显示除AL691432.4和AL138479.2随WHO分级升高而降低外，其余六个风险lncRNA在高分级胶质瘤中表达逐渐升高。IDH突变型中两个保护性lncRNA表达增加，与其保护效应一致。更高恶性程度的病理类型中风险lncRNA表达升高、保护性lncRNA降低。1p/19q共缺失编码组中保护性lncRNA增加、风险lncRNA降低。疾病进展期风险lncRNA升高、完全缓解期降低，保护性lncRNA变化趋势相似。老年患者中风险lncRNA显著升高、保护性lncRNA显著降低。ROC分析显示除治疗相关预后指标外（最高AUC仅0.630），其余评估均有良好诊断效能，最低AUC为0.594，最高达0.913（LINC00092对IDH突变状态）。

讨论部分，研究人员指出将迁移体相关基因表达与lncRNA为基础的胶质瘤风险分层相联系的分析仍然有限。本TCGA探索性研究通过共表达分析联合Cox和LASSO建模识别了八个候选迁移体相关lncRNA，该标志物与生存以及免疫和TMB相关特征相关。风险模型的表观AUC高于WHO分级（0.880 vs. 0.838），但不应解读为确定的临床性能，因此研究人员将该模型框架定位为假设生成而非经过验证的诊断或预后工具。与既往报道的胶质瘤lncRNA标志物相比，本研究的主要特征是去甲向候选选择和免疫浸润、TMB、预测免疫治疗反应、药物敏感性、泛癌生存及胶质瘤临床特征的整合分析，为未来机制研究提供了生物学聚焦的优先策略，但其本身并不能证明功能性的迁移体-lncRNA轴。

研究人员强调胶质瘤主要恶性特征是其浸润和侵袭能力，但具体机制尚不完全清楚。肿瘤微环境改变如缺氧可能促进胶质瘤侵袭，缺氧诱导因子参与增殖、侵袭和干细胞样表型。免疫浸润也与胶质瘤生物学和治疗反应相关。分析显示高风险肿瘤具有更高的估计巨噬细胞比例（包括M2型巨噬细胞）和更高的ESTIMATE衍生的基质及免疫评分，这与小胶质细胞和巨噬细胞构成胶质瘤组织相当比例、M2型巨噬细胞浸润与胶质瘤恶性程度和不良预后相关的既往报道一致。但bulk RNA解卷积无法完全区分驻留小胶质细胞和浸润巨噬细胞，也不能建立细胞间机制。TMB和TIDE结果需要胶质瘤特异性解读：中枢神经系统肿瘤在免疫监视和免疫治疗反应方面与黑色素瘤和非小细胞肺癌不同，TIDE尚未针对胶质瘤优化，因此TMB、TIDE和药物敏感性分析应视为需要在胶质瘤特异性临床或实验系统中验证的探索性预测。

泛癌生存关联分析和临床特征评估显示，六个风险相关lncRNA在恶性特征更显著的胶质瘤组中 tend to 上调，两个保护性lncRNA tend to 呈相反模式。CRNDE在多种癌症中过表达，与肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关；在胶质瘤中，CRNDE升高与增强的增殖迁移、更大肿瘤体积、更高WHO分级和更差生存结局相关。AL390755.1曾被报道通过糖酵解通路参与胶质瘤生物学，但Xu等的报道与本研究TCGA分析模式存在差异，可能反映样本组成、肿瘤分期、平台或分析策略差异。POLR2J4与肝细胞癌和转移性乳腺癌相关，可能通过N6-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）相关通路影响胶质瘤生物学。AC007879.2、LINC00092、AL138479.2和AL691432.4在胶质瘤中的研究较少，本研究结果提名这些lncRNA为未来研究候选，但其功能作用及与迁移体生物学的关系需要直接实验验证。

研究局限性包括：所有分析均为回顾性；三个外部数据集因表达平台未覆盖全部八个模型lncRNA，只能进行可用基因和部分评分分析，无法进行完整模型验证，临床应用前仍需完整外部验证和跨平台稳健性检验；lncRNA与迁移体生物学的关联证据基于中等相关性阈值的共表达，不能证明直接分子相互作用、因果关系或迁移体依赖功能；批次效应、平台差异、缺失临床变量和模型参数选择可能影响估计；免疫解卷积、TMB、TIDE和oncoPredict分析均为计算近似，需要胶质瘤特异性验证；尚需前瞻性临床数据和细胞、动物模型或患者来源样本的实验工作来检验所提出的生物学假设。

研究结论：从迁移体相关共表达候选基因中筛选出的八lncRNA标志物与TCGA胶质瘤数据的生存和免疫微环境特征相关。CGGA325、CGGA693和GSE16011中的可用基因外部分析部分支持可检测模型lncRNA（尤其是CRNDE）的预后相关性，但并未构成完整标志物验证。该模型可能有助于优先排序未来胶质瘤迁移、免疫重塑和治疗反应假设研究的lncRNA。在用于临床决策或被解读为因果迁移体-lncRNA通路的证据之前，需要完整的外部验证和机制实验。