BoNT/E相关蛋白(Neurotoxin-Associated Protein, NAP)破坏肠上皮屏障完整性以促进跨细胞转运(Transcytosis)

《Frontiers in Molecular Biosciences》：BoNT/E-associated protein disrupts intestinal epithelial barrier integrity to facilitate transcytosis

　　

背景：上皮及内皮屏障通过特化的细胞间连接复合体在维持体内区室化中发挥重要作用。E型肉毒杆菌神经毒素(Botulinum neurotoxin type E, BoNT/E)是由产气荚膜梭菌(Clostridium botulinum)产生的约150 kDa蛋白毒素，尽管分子量较大仍能穿越肠上皮屏障。BoNT/E与数种神经毒素相关蛋白(Neurotoxin-Associated Proteins, NAPs)共同产生，被认为有助于毒素稳定性和吸收。其中约80 kDa的蛋白P80(对应OrfX2)被鉴定为BoNT/E相关蛋白，但其在上皮细胞转运中的功能作用尚不清楚。方法：研究人员从BoNT/E前体毒素复合物中纯化P80，并使用圆二色谱(Circular Dichroism, CD)和热变性分析进行表征。通过血凝试验、细胞毒性研究、共聚焦显微镜、原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, AFM)、免疫荧光成像、紧密连接(Tight Junction, TJ)蛋白分析及Caco-2和HT-29肠上皮细胞模型中的跨细胞转运(Transcytosis)实验评估其生物学活性。结果：结构分析显示P80是稳定的、以α螺旋为主且具有明确三级结构的蛋白。P80无 detectable血凝活性，对肠上皮细胞细胞毒性极低。细胞实验表明P80与上皮单层相互作用，诱导肌动蛋白细胞骨架重塑，增加claudin-1磷酸化水平并改变紧密连接组织。AFM和共聚焦显微镜观察到与上皮屏障完整性瞬时调节一致的变化。功能性跨细胞转运研究显示，P80使共孵育的大分子 cargo经极化Caco-2单层的转运显著增强，较未处理对照组约增加5倍。讨论：上述发现表明P80是一种无毒的上皮屏障通透性调节因子，能够增强大分子的旁细胞(paracellular)运输。与经典的含血凝素(Hemagglutinin, HA)神经毒素蛋白不同，P80缺乏血凝活性但保留可逆改变紧密连接动力学的能力。结果表明P80有助于BoNT/E的肠道吸收，并可能作为改善治疗性蛋白及其他亲水性大分子黏膜递送的有前景的生物增强剂(bioenhancer)。需进一步开展体内研究评估其转化潜力。

论文解读：BoNT/E相关蛋白P80破坏肠上皮屏障完整性以促进跨细胞转运

本研究发表于《Frontiers in Molecular Biosciences》。肉毒杆菌神经毒素(Botulinum neurotoxin, BoNT)在自然界中以包含非毒性神经毒素相关蛋白(Neurotoxin-Associated Proteins, NAPs)的复合体形式存在，这些NAPs可保护神经毒素免受胃肠道消化酶降解并促进其吸收。A型BoNT复合物中的血凝素(Hemagglutinin, HA)成分可通过破坏肠上皮细胞间紧密连接(Tight Junctions, TJs)来增强通透性，但E型BoNT(BoNT/E)相关的NAP——尤其是约80 kDa的P80蛋白（对应OrfX2基因产物）——在上皮屏障转运中的具体功能尚不明确。鉴于BoNT/E前体复合物毒性高于纯毒素且需经肠吸收进入循环，阐明P80是否及如何调节上皮屏障对于理解肉毒中毒发病机制及开发口服生物大分子递送系统具有重要意义。研究人员从BoNT/E复合物中纯化P80蛋白，通过圆二色谱(CD)解析二级及三级结构，利用原子力显微镜(AFM)、免疫荧光显微术观察其对Caco-2及HT-29肠上皮单层细胞形态及TJ的影响，检测细胞毒性与血凝活性，并通过极化Transwell体系评估其对标记解毒重组BoNT/A(Detoxified recombinant BoNT/A, DrBoNT/A)旁细胞(paracellular)跨转运的增强效应。

主要关键技术方法：

研究人员从产气荚膜梭菌(Clostridium botulinum) type E Alaska株发酵液中通过DEAE-Sephadex A-50阴离子交换及CM-Sepharose CL-6B阳离子交换层析两步法纯化P80蛋白。采用远紫外及近紫外圆二色谱(CD)结合热变性分析表征蛋白二级/三级结构及热稳定性。以人结肠腺癌来源Caco-2和HT-29细胞系建立极化上皮单层，通过MTT法测细胞活力、血凝试验测糖结合活性、Alexa Fluor 488标记蛋白示踪及共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)观察细胞内化与定位、免疫荧光染色检测F-actin及ZO-1分布、免疫沉淀/Western blot检测claudin-1磷酸化水平、非接触模式原子力显微镜(AFM)观测细胞表面拓扑变化，并在Transwell插入式小室中进行DrBoNT/A与P80或Hn-33共孵育的跨细胞转运(Transcytosis)定量检测。

研究结果：

Expression and purification of P80（P80的表达与纯化）：

研究人员通过阴离子交换层析从BoNT/E复合物中分离出含P80的组分，再经阳离子交换层析去除杂质获得高纯度P80。SDS-PAGE确认纯化产物为主要条带约80 kDa，等电点(pI)计算约为6.3。

Structural characterization of P80 protein（P80蛋白的结构表征）：

远紫外CD光谱在208 nm和220 nm处呈现典型双负极小值，平均残基椭圆度比θ₂₂₂/θ₂₀₈> 1，表明P80以α螺旋(α-helix)为主并具卷曲螺旋(coiled-coil)特征，含部分无规卷曲。近紫外CD光谱在芳香氨基酸吸收区有强信号，证实具稳定折叠的三级结构。热变性监测222 nm和280 nm信号，二级与三级结构熔融温度(T_m)分别为62.37±0.06°C和63.11±0.18°C，呈协同 unfolding，说明P80在生理温度下结构稳定。

Evaluation of P80 toxicity and hemagglutination activity（P80毒性与血凝活性评价）：

MTT法显示75–300 nM P80处理Caco-2细胞24 h后线粒体活性与对照组无显著差异，表明无明显细胞毒性。血凝试验中间浓度5–50 μg P80不能凝集人O型红细胞，阴性对照BSA同样不凝集，阳性对照Hn-33（BoNT/A HA组分）在低至5 μg即出现凝集，证实P80不具备血凝(hemagglutination)活性。

Differential interactions of P80 with intestinal epithelial cells and its effect on transcytosis（P80与肠上皮细胞的差异相互作用及其对跨细胞转运的影响）：

Alexa Fluor 488标记P80在Caco-2细胞中主要沿质膜分布、较少深入胞质；在HT-29细胞中则较多内化至胞质，与Hn-33呈相反趋势。荧光定量显示P80在两细胞系中平均摄取信号均高于Hn-33。AFM形貌成像显示对照Caco-2单层呈紧密蜂巢状排列；150 nM Hn-33处理24 h引起轻微细胞间隙条纹；150 nM P80处理则导致细胞间明显分离、连接松散，提示P80能更显著地影响TJ完整性。免疫荧光显示P80处理后肌动蛋白(actin) cytoskeleton发生轻度重排，细胞外围出现暗色边界；Hn-33引起更明显的actin向胞内重排。免疫沉淀-Western blot显示P80及Hn-33均使claudin-1丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化水平较对照升高约1.38倍，提示二者通过claudin磷酸化调节TJ通透性。

Role of P80 in transcytosis（P80在跨细胞转运中的作用）：

在极化Caco-2单层顶侧共加入Alexa Fluor 488标记的DrBoNT/A与150 nM P80或Hn-33，定时收集基底侧液测荧光。结果显示DrBoNT/A经P80或Hn-33处理组基底侧出现时间依赖性增加，24 h时P80组DrBoNT/A转运量约为未处理对照的5倍，与Hn-33组相当(p > 0.05 vs Hn-33组；p < 0.001 vs 对照组)。在HT-29单层中间差异无统计学意义，可能与该细胞系TJ特性不同有关。

讨论与结论总结：

研究人员证实P80是从BoNT/E前体毒素复合物中纯化的稳定、以α螺旋为主的NAP，无细胞毒性和血凝活性。P80通过与肠上皮作用诱导actin cytoskeleton适度重塑及claudin-1磷酸化上调，可逆性松弛紧密连接、拓宽细胞间隙，从而显著增强大分子旁细胞(paracellular)通透并促DrBoNT/A跨上皮转运，效果与经典HA组分Hn-33相当但不具糖结合活性。P80代表了不同于HA类NAP的上皮屏障调节机制——低毒、非血凝、可控地调节TJ动态，既参与BoNT/E经肠吸收过程，也具备作为口服生物大分子（治疗性蛋白、多肽）递送用生物增强剂(bioenhancer)的潜力。未来需在动物模型中验证其体内屏障调节可逆性、药代动力学及安全性，并进一步解析其信号通路及与BoNT的直接结合关系。