石墨烯纳米片用于颅内直流电刺激的生物性能评估

《Frontiers in Neuroscience》：Biological performance evaluation of graphene nanoplatelets for intracranial direct current stimulation

　　

石墨烯纳米片（GNPs）因其高电荷注入容量、柔韧性和生物相容性，为神经接口应用（特别是颅内直流电（DC）刺激）提供了有前景的特性。在本研究中，研究人员全面评估了基于GNP的电极在急性和慢性皮层刺激与记录中的生物学和功能性能。GNP电极通过丝网印刷在柔性聚酰亚胺基底上制备。使用RAW 264.7巨噬细胞系和原代海马培养物评估其细胞毒性，未发现细胞死亡或毒性证据。在非人灵长类动物中长达50天的长期植入未显示感染、炎症或皮层损伤迹象，支持该材料的生物稳定性。磁共振成像（MRI）确认GNPs不产生成像伪影，证实其与标准神经影像学方案的兼容性。功能上，使用GNP电极进行硬膜外DC刺激以极性依赖方式调节听觉皮层神经元放电率，与DC刺激的经典效应一致。此外，同一电极可靠地记录了听觉诱发电位，展示了刺激与记录的双重功能。这些发现将丝网印刷GNP电极定位为神经生理学应用中安全、多功能且有效的工具，并强调了其在转化神经科学和神经治疗领域的未来潜力。

**石墨烯纳米片电极在颅内直流电刺激中的生物性能评估：从机制到应用**

**研究背景与问题**

直流电（DC）刺激皮层组织是系统神经科学中调节脑状态的经典方法，可通过经颅直流电刺激（tDCS）或颅内直流电刺激（iDCS）实现。早期动物研究（Creutzfeldt等，1962；Bindman等，1964；Purpura和McMurtry，1965）表明，低强度电流通过改变神经元静息膜电位来调节皮层兴奋性：阴极刺激引起膜超极化并降低放电率，阳极刺激则导致去极化并增加放电率。然而，与交流电刺激相比，DC刺激对生理状态和行为的影响知之甚少，部分原因在于缺乏合适的设备（Aplin和Fridman，2019）。传统iDCS常采用穿透性或非穿透性金属电极（如银-氯化银（Ag/AgCl）电极），但研究人员在初步测试中发现，这些电极在电极-组织界面发生显著电解，严重损害其耐久性和实用性。更重要的是，电极腐蚀可能因释放银离子而引发皮层组织炎症反应（Wu和Tang，2018）。碳同素异形体（如石墨烯）具有比传统金属电极（包括铂电极）更高的电荷注入容量，且与活体组织接触时更安全（Vomero等，2016；2017）。然而，每种电极材料必须经过彻底研究以确保安全并防止潜在组织损伤（Kumsa等，2017；Harris等，2018）。研究人员前期工作（Pep?owski等，2020）已证明基于石墨烯纳米片（GNP）的脑刺激电化学安全性。本研究旨在评估GNP电极的生物安全性，确定其是否适用于急性和慢性脑研究应用。

**研究内容与意义**

研究人员全面评估了丝网印刷GNP电极的生物相容性、磁共振（MR）兼容性、刺激与记录功能。通过体外细胞毒性实验、非人灵长类动物长期植入（50天）、MR成像、硬膜外DC刺激和听觉诱发电位记录，证实GNP电极无细胞毒性、无炎症反应、无MR伪影，并能有效调节神经元活动并记录皮层信号。这些发现表明GNP电极是安全、多功能且有效的神经生理学工具，具有转化神经科学和神经治疗应用的潜力。论文发表在《Frontiers in Neuroscience》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用丝网印刷技术在25.4 μm厚的聚酰亚胺箔（Kapton^? 100HN）上制备GNP电极，银导线层绝缘后形成刺激位点。机械性能通过最小弯曲半径测试（1 mm半径，2分钟）评估，电阻变化率（ΔR/R₀）低于10%阈值，并用扫描电子显微镜（SEM）检查表面损伤。粘附性依据ISO 2409标准进行划格胶带测试。细胞毒性使用RAW 264.7巨噬细胞系和原代海马培养物（取自胚胎18-19天大鼠，遵循德国动物研究伦理标准）评估，通过免疫细胞化学（MAP2、GFAP抗体）和碘化丙啶（PI）染色观察。MR成像在3-Tesla扫描仪上采用3D T1加权MP-RAGE序列，电极置于鸡肉层间模拟真实场景。体内实验在3只成年雄性食蟹猴（Macaca fascicularis）上进行，电极经硬膜外植入听觉皮层上方，使用多电极记录多单元活动，DC刺激强度为-0.5和+0.5 mA，持续15秒，记录听觉诱发电位（100次点击声，70 dB SPL）。

**研究结果**

**3.1 GNP电极的机械弯曲测试**：6个样本的归一化电阻平均比值为1.03 ± 0.03（均值±标准差，n=6），相对增加仅3 ± 3%，远低于10%接受阈值。SEM图像显示弯曲前后无裂纹、分层或表面退化，证实电极在柔性基底上具有高机械稳定性。

**3.2 MR成像**：GNP电极置于鸡肉层间进行MR扫描，未产生任何成像伪影，且无热驱动损伤迹象，表明GNP电极在标准成像协议下具有MR透明性和兼容性。

**3.3 细胞毒性测试**：RAW 264.7细胞在含GNP电极的12孔板中培养后，形态和空间分布与无电极对照组相当，无大量非贴壁（可能死亡）细胞。原代海马培养物暴露于GNP 24和48小时后，MAP2阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞染色模式与未处理对照组一致，PI阳性细胞核数量相似，表明GNP暴露未导致细胞死亡或形态改变。

**3.4 长期植入对脑组织的影响**：在非人灵长类动物中，GNP电极植入硬膜外50天后，打开不锈钢圆柱体观察到电极表面覆盖一层薄软组织伴轻微血管化，无感染迹象。电极可轻松移除，下方脑表面仍覆盖一层薄纤维组织，与植入前状态相似，表明GNP电极未引起明显炎症或皮层损伤。

**3.5 硬膜外DC刺激调节神经元活动**：通过硬膜外GNP电极施加直流电，记录听觉皮层约7 mm深处8个多单元位点的放电率。阴极刺激（-0.5 mA）使放电率显著抑制约10%（Wilcoxon符号秩检验，p=0.028），阳极刺激（+0.5 mA）使放电率显著增加约65%（p=1.5×10^-4），与经典DC极化效应一致。

**3.6 颅内听觉诱发电位测量**：使用硬膜外GNP电极记录100次点击声诱发的皮层电位，平均场电位呈现明显的负向偏转，正向偏转不明显，表明GNP电极能有效记录颅内皮层电图信号。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究证明丝网印刷GNP电极在iDCS和神经记录中不仅电化学有效，而且生物安全。体外细胞毒性实验和体内非人灵长类长期植入结果支持GNP的生物相容性，与先前石墨烯基材料研究一致（Capasso等，2021；Chiacchiaretta等，2018；Fabbri等，2024；Viana等，2024）。传统材料如Ag/AgCl和铂在慢性应用中常受腐蚀、电解和潜在毒性限制（Wu和Tang，2018；Li等，2024），而GNP电极提供高电荷容量、机械柔韧性和最小炎症反应，适合长期植入。丝网印刷工艺支持低成本、可扩展生产，电极可贴合脑表面复杂几何形状。GNP电极的电荷注入容量（>3 mC/cm²）优于铂（约0.35-0.5 mC/cm²）和Ag/AgCl。功能上，GNP电极成功调节神经元活动并记录听觉诱发电位，展示双重功能。其MR透明性允许同步脑刺激和成像。与碳纳米管电极相比，GNP电极通过印刷工艺更易于大规模定制和低成本制造。未来研究需探索超过50天的慢性刺激效应及石墨烯与神经胶质组织的分子相互作用。

**研究结论**：研究人员的发现支持石墨烯基材料代表神经接口技术重大进展的观点。基于GNP的电极结合了生物相容性、电化学性能和功能多样性，使其成为基础神经科学和神经治疗应用中下一代工具的有力候选者。