《Veterinary Research》：Different replication behavior of a contemporary porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus strain Gent/PS412 compared with the historical neurotropic reference strain VW572
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猪凝血性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV）于1957年首次被发现，一直被描述为猪的神经嗜性病毒。然而，近期分离的毒株主要与呼吸道问题相关。本研究比较了1972年在作为历史
猪凝血性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV）于1957年首次被发现，一直被描述为猪的神经嗜性病毒。然而，近期分离的毒株主要与呼吸道问题相关。本研究比较了1972年在作为历史神经嗜性毒株VW572与2020年当代毒株PS412（监测研究中于荷兰从猪鼻腔分泌物中分离）的复制动力学，所用体系包括RPD（rein de porc diploid）细胞、鼻黏膜和筛骨黏膜外植体以及原代猪呼吸道上皮细胞（PoRECs）。研究人员使用EGTA破坏细胞间连接以促进病毒接触基底侧受体。在RPD细胞中，VW572在感染早期表现出起始优势，而PS412在后期展现出更强的复制与病毒释放能力，提示两毒株存在不同的复制动力学。两种毒株在鼻外植体和PoRECs中的复制动力学无显著差异。在筛骨外植体中，PHEV仅在支持细胞（sustentacular cells）中复制，且VW572感染的细胞数量多于PS412。EGTA处理对鼻外植体中PHEV感染无影响，但能显著增加VW572在PoRECs和筛骨外植体中的感染，提示VW572在支持细胞中对基底侧受体有更强的依赖性。基因组分析鉴定出刺突蛋白（spike protein）受体结合位点的2个突变导致氨基酸改变：N512K、K576E。这些变化改变了刺突蛋白表面的区域极性，可能影响PHEV的受体利用。综上所述，历史与当代PHEV分离株VW572和PS412在上呼吸道呼吸/神经组织中的复制方式存在差异，这可能与刺突蛋白受体结合域的氨基酸变异相关。
《兽医研究》（Veterinary Research）发表的这项研究聚焦于猪凝血性脑髓炎病毒（PHEV）两种毒株的复制行为差异，旨在解析该病毒从历史上的神经嗜性向当代呼吸道适应性演变的分子基础。
PHEV属于冠状病毒科（Coronaviridae）β冠状病毒属（Betacoronavirus）的Embecovirus亚属，为包膜正义单链RNA病毒，基因组约25–30 kb，编码刺突蛋白（S)、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）四种结构蛋白，其中S蛋白介导受体识别与膜融合。该病毒还编码血凝素酯酶（HE）蛋白。PHEV于1957年在加拿大首次暴发，（比利时）VW572株系1972年从发病猪扁桃体中分离的经典神经嗜性参考株，主要表现为呕吐消瘦综合征和脑脊髓炎；而当代流行株PS412于2020年从荷兰猪场监测性鼻腔拭子中分离，主要与呼吸道症状相关。目前PHEV呕吐消瘦病和脑脊髓炎已罕见报道，推测可能与仔猪母源被动免疫或病毒长期适应进化有关。然而，驱动这种临床表型转变的病毒学机制尚不明确，尤其缺乏历史毒株与当代毒株在呼吸道及神经组织中的系统性比较研究。
为探究VW572与PS412在复制动力学、组织嗜性及受体利用方面的差异，研究人员开展了系列比较研究。研究采用了RPD细胞系、猪鼻黏膜外植体、筛骨（嗅觉）黏膜外植体以及原代猪呼吸道上皮细胞（PoRECs）四种感染模型，并应用EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸）处理破坏细胞间紧密连接以评估基底侧受体的可及性。通过免疫荧光染色、病毒滴定测定（TCID??）及基因组测序结合AlphaFold 3结构预测等技术，系统比较了两毒株的感染特征。
研究结果部分：
在RPD细胞中VW572感染早期更高效而PS412后期占主导：免疫荧光显示两毒株均在RPD细胞中有效复制，18 hpi时VW572感染细胞百分比显著高于PS412（p=0.019），而48 hpi时PS412显著反超（p=0.017）。胞外病毒滴定显示PS412在所有检测时间点均显著高于VW572（p=0.013）；胞内滴度仅在24 hpi和48 hpi时PS412显著更高。这表明VW572感染启动更快，而PS412具有更强的后期复制与释放能力。
PHEV感染的呼吸道黏膜外植体凋亡评估：TUNEL染色显示模拟感染与病毒感染外植体中凋亡细胞比例均较低，病毒抗原与凋亡标志物无共定位，48 hpi时凋亡细胞略有增加但与处理条件无关，提示PHEV感染未引起显著凋亡或外植体活力下降。
鼻黏膜中两PHEV毒株均偏好顶面感染途径：鼻黏膜外植体中两毒株感染模式相似，24 hpi和48 hpi感染细胞数无显著差异。EGTA预处理对两毒株感染均无显著影响，提示鼻黏膜中病毒主要通过顶面受体进入。胞外滴度在两毒株间亦无显著差异，24 hpi分别为10
2.43 TCID??/mL（VW572）和10
2.02 TCID??/mL（PS412）。
嗅觉黏膜中PHEV感染仅限于支持细胞且存在株间差异：双免疫荧光显示所有PHEV阳性细胞均与细胞角蛋白18（CK18）标记的支持细胞共定位，嗅感觉神经元未被感染。VW572在24 hpi和48 hpi感染的支持细胞数显著多于PS412。EGTA处理显著增加VW572感染（p<0.001），但对PS412无影响。然而PS412的胞外滴度更高，48 hpi时生产力为VW572的1.64倍，提示PS412虽有更低的感染细胞数但单细胞产病毒量更高。
原代猪呼吸道上皮细胞中VW572对EGTA驱动感染更敏感：PoRECs经EMA检测活力>98.99%。两毒株通过顶面和基底面感染效率相似，但EGTA预处理仅对VW572产生显著增强效应（p=0.0009），PS412呈非显著性增加趋势，表明两毒株对上皮极性破坏的响应存在差异。
两毒株刺突蛋白受体结合域突变可能影响结构与功能：全基因组比较显示PS412基因组（30,431 nt）略短于VW572（30,467 nt）。刺突蛋白氨基酸序列存在7处差异，其中2处位于S1蛋白预测受体结合域（RBD）的512和576位：VW572的512位天冬酰胺（极性不带电）变为PS412的赖氨酸（正电荷），576位赖氨酸（正电荷）变为谷氨酸（负电荷）。AlphaFold 3结构预测显示这些改变导致刺突蛋白表面电荷分布变化，可能影响受体识别。
讨论部分的要点总结如下：PHEV已知引起呕吐消瘦病和脑脊髓炎两种综合征，VW572作为强神经嗜性参考株与当代呼吸道适应性毒株PS412存在表型差异。鼻黏膜是PHEV原发复制部位，嗅黏膜亦是潜在感染靶点。上皮细胞顶面和基底面受体由紧密连接分隔，EGTA可逆性破坏紧密连接以暴露基底侧受体。该研究发现鼻外植体中EGTA未增强感染，提示两毒株均主要利用顶面受体；而VW572在PoRECs和嗅觉外植体中对EGTA敏感，PS412则不敏感，表明VW572更依赖基底侧受体。支持细胞作为嗅觉上皮的关键支持细胞，其功能障碍可破坏上皮屏障，可能为病毒侵入嗅球提供途径；VW572对支持细胞的高嗜性可能增强其神经侵入风险，而PS412较低的嗅黏膜感染能力提示其神经嗜性减弱。研究还指出所用神经元标志物（NCAM、OMP、β-tubulin III）因种属交叉反应性问题未能标记猪嗅觉神经元，为方法学局限。此外，外植体保留三维组织结构而PoRECs经酶处理可能导致受体重分布，这种模型差异需在解释结果时予以考虑。AlphaFold 3预测虽揭示RBD电荷变化，但尚需冷冻电镜等实验技术进一步验证。
研究结论翻译：综上所述，历史毒株VW572和当代毒株PS412在上呼吸道呼吸/神经组织中的复制方式存在差异，这可能与刺突蛋白受体结合域的氨基酸变异有关。PHEV PS412已部分丧失在嗅觉黏膜中复制的能力；尽管感染细胞数较低，但PS412的单细胞 producers 病毒产量更高（为VW572的1.64倍）。VW572利用嗅觉黏膜和PoRECs中的基底侧受体，而PS412偏好顶面受体，这提示两毒株在嗅觉黏膜中可能利用不同受体。该研究为理解PHEV的组织嗜性演变及受体利用策略差异提供了基础数据。
