心力衰竭治疗的半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他汀（E64d）的临床前评价

《Journal of Molecular Medicine》：Preclinical evaluation of cysteine protease-inhibitor aloxistatin (E64d) for heart failure therapy

　　

心力衰竭（HF）影响着全球超过6400万人，并与纤维化瘢痕形成存在因果关联。目前可用的心脏药物均未直接靶向纤维化，这凸显了对新型疗法的未满足临床需求。本研究旨在探索半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他汀作为一种再利用候选药物，在预测性心力衰竭模型中对抗纤维化进展的治疗潜力。阿洛司他汀降低了源自不同心力衰竭背景的人心脏成纤维细胞（HCFs）的迁移和增殖能力。从机制上讲，阿洛司他汀通过抑制细胞外基质组织相关基因的表达以及基质金属蛋白酶2（MMP2）和纤连蛋白1（FN1）的分泌，减弱了心肌病来源的HCFs中转化生长因子β1（TGFβ1）诱导的促纤维化信号传导，这一过程部分由钙蛋白酶2（CAPN2）抑制介导。对大鼠离体心肌切片进行的转录组分析显示，阿洛司他汀显著抑制了炎症通路。阿洛司他汀的抗炎作用通过报告细胞中核因子κB（NFκB）活性的降低以及人诱导多能干细胞（iPSC）源性巨噬细胞中人白细胞抗原-DR（HLA-DR）表达的抑制得到进一步证实。多种临床前心脏心力衰竭模型的应用有力地表明，阿洛司他汀通过同时对抗心肌炎症信号传导和促纤维化机制，成为一种潜在的药物再利用策略。这项临床前研究表明，阿洛司他汀疗法具有转化应用潜力，可减轻心脏重塑和心力衰竭的进展。

**心力衰竭治疗新策略：阿洛司他汀靶向纤维化与炎症的临床前研究**

**研究背景与意义**
心血管疾病（CVDs）是全球主要的死亡原因，其中缺血性心肌病（ICM）和扩张型心肌病（DCM）是导致心力衰竭（HF）的常见病理类型。尽管病理背景不同，两者均涉及心脏的慢性纤维化重塑，即心肌细胞外基质（ECM）过度沉积，导致心肌僵硬和功能进行性丧失，最终发展为心力衰竭。目前，基于欧洲心脏病学会（ESC）指南的药物治疗主要缓解症状，但无法阻止潜在的纤维化进展。尚无直接靶向心脏纤维化的疗法获批，或已测试的药物存在安全性问题，因此迫切需要开发新的治疗策略。纤维化在细胞和分子水平上是一个由细胞应激或组织损伤引发的动态、多阶段过程，涉及炎症反应、心脏成纤维细胞（HCFs）活化为肌成纤维细胞以及ECM的过度产生。半胱氨酸蛋白酶家族成员，如钙蛋白酶（Calpains）和组织蛋白酶（Cathepsins），在炎症NFκB通路激活、NLRP3炎症小体活化及ECM重塑中起关键作用，且在心脏纤维化进展中失调，使其成为有前景的治疗靶点。药物再利用策略，即发现现有药物的新治疗用途，可显著缩短开发时间、降低成本并降低风险。本研究聚焦于广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他汀（E64d），评估其作为治疗心脏纤维化的再利用候选药物的潜力。该研究发表于《Journal of Molecular Medicine》。

**关键技术方法概述**
本研究采用多层次的临床前模型系统评估阿洛司他汀的抗纤维化和抗炎作用。核心实验体系包括：使用来源于ICM和DCM患者的原代人心脏成纤维细胞（HCFs）进行体外二维培养，以评估药物对细胞迁移、增殖、基因表达及蛋白分泌的影响；利用Wistar大鼠左心室组织制备三维离体存活心肌切片（LMS），该模型保留了天然的心脏结构、细胞-细胞相互作用和ECM组织，用于模拟体内环境并分析药物对组织转录组的影响；使用人胚胎肾293FT（HEK293FT）细胞进行NFκB报告基因检测，以量化药物对炎症信号通路的抑制作用；以及通过人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为巨噬细胞（iPSC-Mac），评估药物对免疫细胞炎症表型的影响。此外，研究通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，并利用小干扰RNA（siRNA）敲低技术探究特定靶点（如CTSB和CAPN2）在药物作用机制中的角色。

**研究结果分析**

**1. 阿洛司他汀降低病变HCFs的迁移和增殖能力**
作为心肌纤维化的核心效应细胞，HCFs的过度增殖、迁移和ECM沉积是驱动瘢痕形成的关键。研究首先评估了阿洛司他汀对ICM和DCM来源HCFs生物学功能的影响。结果显示，阿洛司他汀显著降低了DCM来源HCFs的迁移活性，但对ICM来源HCFs的迁移无显著影响。更重要的是，阿洛司他汀处理显著抑制了ICM和DCM两种来源HCFs的增殖能力，且未影响细胞总体活力。初步安全性评估在猪LMS和人肝切片模型中进行，表明在有效浓度下，阿洛司他汀未对心脏电生理产生不良影响，且肝细胞活力得以维持，为其安全性提供了支持。

**2. 转录组分析揭示阿洛司他汀调控细胞增殖与ECM形成**
为验证功能学结果，研究人员对阿洛司他汀处理的HCFs进行了mRNA测序。分析发现197个差异表达基因（DEGs）。富集分析显示，这些基因显著富集于与增殖相关的通路，如“前期染色体凝缩”、“G₂/M期DNA损伤检查点”和“细胞群体调控”。同时，阿洛司他汀强烈影响ECM相关过程，如“细胞外基质组织”、“胶原形成”和“胶原纤维组装”。具体而言，阿洛司他汀下调了多种胶原基因（如COL12A1、COL21A1）和纤维化相关标志物，并调控了细胞周期相关标志物如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）和存活素（BIRC5）的表达。定量PCR（qPCR）进一步证实了阿洛司他汀对CDKN1A和COL12A1的调控作用，且此效应与心肌病背景无关。

**3. 阿洛司他汀抑制TGFβ1诱导的成纤维细胞活化与ECM重塑**
为模拟疾病进展中的急性激活状态，研究用促纤维化因子TGFβ1刺激HCFs。RNA测序鉴定出1527个TGFβ1刺激后的DEGs，且这些基因显著富集于纤维化相关通路。当HCFs在TGFβ1刺激下同时接受阿洛司他汀处理时，发现了156个与单纯TGFβ1刺激重叠的DEGs。关键的是，阿洛司他汀几乎完全逆转了这156个重叠基因因TGFβ1刺激而发生的变化。qPCR验证证实，阿洛司他汀能显著抑制TGFβ1诱导的关键促纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（ACTA2）和结缔组织生长因子（CTGF）的表达。对逆转基因的富集分析显示，ECM相关术语是其中最富集的通路之一。在蛋白水平上，阿洛司他汀处理下调了纤连蛋白1（FN1）的分泌，并有效抑制了TGFβ1暴露引起的基质金属蛋白酶2（MMP2）分泌的显著上调。

**4. 离体心肌切片模型再现早期促纤维化特征**
为将体外发现向临床转化，研究采用了三维仿生的离体存活心肌切片（LMS）模型。研究发现，LMS在培养过程中（4小时 vs 24小时）自身就发生了显著的基因表达变化，鉴定出5355个DEGs。这些基因富含ECM重塑和炎症相关通路，表明单纯的LMS培养足以模拟不良心肌重塑的早期事件，包括白细胞介素1β（Il1β）、白细胞介素6（Il6）、骨膜蛋白（Postn）和Ctgf等标志物的上调。

**5. 阿洛司他汀治疗阻断大鼠LMS中的炎症反应**
在LMS模型中，阿洛司他汀处理4小时和24小时后，分别导致179个和1178个基因显著失调。值得注意的是，在4小时下调的103个基因中，大多数在24小时仍持续下调。这些持续下调的基因中包含许多炎症相关候选基因，如选择素E（Sele）、白血病抑制因子（Lif）、白细胞介素6（Il6）、白细胞介素11（Il11）和集落刺激因子2（Csf2）。机制上，在HEK293FT报告细胞中，阿洛司他汀处理显著降低了NFκB的活性。在人iPSC源性巨噬细胞中，阿洛司他汀处理减弱了干扰素γ（IFNγ）诱导的HLA-DR表达上调，证实了其抗炎作用。此外，在过氧化氢（H₂O₂）刺激的HCFs中，阿洛司他汀降低了活性氧（ROS）的产生。综合分析TGFβ1刺激的HCFs和24小时培养的LMS中阿洛司他汀调控的DEGs的富集通路，发现两者共同涉及的关键生物学过程主要与炎症反应（如细胞因子活性）和纤维化重塑（如细胞群体增殖、细胞迁移、ECM-受体相互作用）相关，凸显了阿洛司他汀在两种模型中作用机制的一致性。

**6. 阿洛司他汀的抗纤维化作用部分由CAPN2抑制介导**
为探究阿洛司他汀作用的分子靶点，研究分析了HCFs中半胱氨酸蛋白酶家族成员的表达。发现组织蛋白酶B（CTSB）、组织蛋白酶L（CTSL）以及钙蛋白酶2（CAPN2）、钙蛋白酶1（CAPN1）是表达最丰富的成员。通过siRNA敲低CTSB或CAPN2，研究人员探究了它们是否介导阿洛司他汀的作用。有趣的是，CTSB敲低倾向于增强TGFβ1的促纤维化效应，而阿洛司他汀处理可以挽救此效应。更重要的是，CAPN2的敲低消除了阿洛司他汀在TGFβ1刺激下对成纤维细胞活化标志物CTGF和ACTA2表达的抑制作用。然而，对于COL12A1和CDKN1A的表达，未观察到CAPN2敲低能消除阿洛司他汀的效应。CAPN2敲低本身显著降低了细胞周期抑制剂CDKN1A的表达，而阿洛司他汀处理又能使其表达回升，这一现象在功能上通过BrdU增殖实验得到了反映。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，目前尚无直接逆转心脏纤维化的疗法。临床主流药物如钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i，格列净类）或肠促胰素类似物主要通过心外途径支持心脏修复。本研究表明，阿洛司他汀在纤维化早期和晚期均显示出作为心脏纤维化治疗药物再利用候选物的巨大潜力。其抗炎作用机制涉及抑制钙蛋白酶介导的IκBα降解（从而抑制NFκB活化）以及抑制组织蛋白酶介导的NLRP3炎症小体激活，从而减少促炎细胞因子（如IL-1β, IL-18）的产生。在LMS模型中观察到的炎症标志物下调进一步支持了其在组织层面的抗炎效果。

在纤维化进展方面，阿洛司他汀通过抑制病变HCFs的增殖、迁移和胶原表达，并逆转TGFβ1诱导的促纤维化基因（如ACTA2, CTGF）和ECM成分的上调，发挥抗纤维化作用。敲低实验表明，CAPN2部分介导了阿洛司他汀对成纤维细胞活化的抑制作用，但其对增殖抑制和部分ECM标志物调控的作用可能涉及其他机制。这提示阿洛司他汀可能通过调节钙蛋白酶系统的失衡来恢复蛋白水解稳态。然而，本研究的结果尚不能完全阐明阿洛司他汀所有作用的精确机制，未来需要更深入的研究，例如在人类3D LMS模型中进行单细胞测序分析。

鉴于新药研发的高失败率和巨大成本，药物再利用是一种可行的替代策略。本研究为阿洛司他汀的再利用提供了坚实的临床前证据。

**研究结论**
综上所述，钙蛋白酶和组织蛋白酶抑制剂阿洛司他汀在多种心脏模型（包括HCFs、啮齿动物LMS和hiPSC源性巨噬细胞）中均表现出强大的抗纤维化和抗炎作用。通过减少成纤维细胞增殖、迁移和ECM形成，并减弱促炎信号传导，阿洛司他汀有效地靶向了驱动纤维化进展的核心细胞机制。这些发现共同凸显了阿洛司他汀的双重作用模式，并强调了其作为治疗心脏纤维化和不良进展为心力衰竭的再利用治疗候选药物的巨大潜力。