《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：A comparison of two vitrification methods and the effect of dimethyl sulfoxide in vitrification solution for cryopreservation of Euterpe edulis Martius (Arecaceae)
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巴西棕榈 Martius（棕榈科，Arecaceae）是大西洋森林生物多样性热点地区的本土物种，具有重要的生态与经济价值。其果实通过为鸟类和哺乳动物提供食物而促进生物多样性维持，并因其抗氧化特性及在食品和化妆品工业中的应用而受到
巴西棕榈 Martius（棕榈科，Arecaceae）是大西洋森林生物多样性热点地区的本土物种，具有重要的生态与经济价值。其果实通过为鸟类和哺乳动物提供食物而促进生物多样性维持，并因其抗氧化特性及在食品和化妆品工业中的应用而受到重视。然而，栖息地丧失与繁殖受限共同导致该物种处于受威胁状态，从而强化了对补充性异地保存（ex situ conservation）策略的需求。因此，本研究评估了巴西棕榈体细胞胚的冷冻保存，比较了常规玻璃化法与滴液玻璃化法，并结合使用添加不同浓度二甲基亚砜（DMSO；0、5、10 和 15%）的改良植物玻璃化溶液3（Plant Vitrification Solution 3，PVS3）。结果表明，两种玻璃化方法在复温后恢复方面未观察到显著差异。然而，添加10%和15% DMSO的PVS3较0%和5% DMSO显著提高了存活率，其中15% DMSO条件下获得最大值（滴液玻璃化法为67.50%，常规玻璃化法为69.50%）。扫描电子显微镜（SEM）显示，冷冻保存后处于更高级成熟阶段的体细胞胚发生了更明显的结构改变；透射电子显微镜（TEM）显示，不同处理之间存在依赖处理的细胞超微结构差异，包括液泡化、细胞壁破坏以及存活细胞中细胞核组织的保持。基于能量色散X射线能谱（EDS）的元素分析显示，不同冷冻保存处理之间存在差异；复温后存活率较高的处理表现出更高的碳信号强度，而较低存活率与较低碳信号强度相关。该技术显示出保存受威胁巴西棕榈成株种质资源的潜力，并可为遗传改良项目提供战略性支持。
该文发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》，围绕大西洋森林关键树种巴西棕榈
Martius的异地长期保存展开研究。该物种兼具生态功能与经济价值：一方面，其果实是多种鸟类和哺乳动物的重要食物来源，对维系森林食物网和生物多样性具有重要意义；另一方面，其果肉具有抗氧化、抗炎和心脏保护相关活性，在食品及化妆品产业中具有开发潜力。然而，天然栖息地持续破坏、野外种群下降以及常规繁殖与保存受限，使该物种被列为受威胁物种。在此背景下，建立稳定、可重复的冷冻保存体系，成为补充原地保护和常规离体保存的重要手段。冷冻保存可在液氮（LN，liquid nitrogen）超低温条件下终止代谢活动，从而实现生物材料长期稳定保存，并避免长期继代培养可能带来的体细胞变异（somaclonal variation）累积。因此，针对巴西棕榈建立适宜的体细胞胚冷冻保存技术，既具有种质资源保护价值，也与遗传改良材料的长期维持密切相关。
目前该领域面临的核心问题在于，不同植物材料对玻璃化保护剂体系和降温方式的响应差异显著，尤其是棕榈科（Arecaceae）材料通常组织含水量高、对化学和渗透胁迫敏感，导致标准玻璃化体系并不一定适用。已有研究已在油棕、椰子和桃棕等棕榈科植物中报道了冷冻保存应用，但巴西棕榈尚缺乏成熟方案。研究人员据此选择体细胞胚作为保存材料，比较常规玻璃化法与滴液玻璃化法两种策略，并以毒性相对较低的PVS3作为基础玻璃化溶液，通过添加不同浓度二甲基亚砜（DMSO，dimethyl sulfoxide）调节膜通透性与脱水效率，以寻找更适于该物种的冷冻保存条件。研究结果表明，两种玻璃化方法在复温后恢复方面无显著差异，但DMSO浓度显著影响存活与再生表现，其中10%和15% DMSO处理优于0%和5%，15% DMSO获得最高存活率。超微结构与元素分析进一步说明，较高存活处理具有更好的细胞结构保持状态。总体上，该研究建立了巴西棕榈体细胞胚长期异地保存的可重复方案，对受威胁棕榈类植物种质资源保护具有现实意义。
就主要技术方法而言，研究人员首先取自巴西联邦圣埃斯皮里图州供体植株未成熟花序，建立离体培养体系并诱导间接体细胞胚发生；随后对含10–15个体细胞胚的胚簇进行蔗糖梯度渗透预成熟处理，再分别采用常规玻璃化法和滴液玻璃化法，在添加0、5、10、15% DMSO的改良PVS3中实施液氮冷冻保存。复温后通过成熟培养、萌发与成苗培养评估存活和再生，并对再生植株进行离体驯化。为解析组织损伤与保护状态，研究进一步采用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、甲苯胺蓝染色组织学分析以及能量色散X射线能谱（EDS）进行形态结构与元素组成评价。
在研究结果部分，论文首先报告了不同DMSO浓度对冷冻后存活的影响。结果显示，复温后氧化褐变在不添加DMSO和仅添加5% DMSO的处理中更为明显，体细胞胚表现为褐色至深褐色；而10%与15% DMSO处理褐变较轻，外观保存更好。定量结果表明，DMSO是提高复温后存活率的关键因素：0% DMSO存活率最低，仅为10.5%；5% DMSO升至36.75%；10% DMSO较对照提高31.5%；在常规玻璃化条件下，10% DMSO（68.25%）与15% DMSO（69.5%）之间差异不显著。该结果说明，在PVS3基础上增加适当浓度DMSO，有助于提升冷冻保护效果。
随后，论文比较了两种玻璃化方法的整体表现。研究指出，无论在存活率还是后续驯化方面，常规玻璃化法与滴液玻璃化法之间均未检测到统计学显著差异。两种方法在各DMSO浓度下都表现出相近的复温后恢复水平。这一结果说明，在本研究所设定条件下，影响巴西棕榈体细胞胚冷冻保存成效的主要因素并非玻璃化方式本身，而是玻璃化溶液中DMSO的补充水平。与此同时，10%和15% DMSO处理的离体驯化率最高，平均分别达到55.57%和58.33%，进一步说明较优冷冻保护条件不仅改善复温后生存，也有利于后续植株建立。
在“冷冻后组织结构与发育阶段差异”方面，研究通过形态和显微观察发现，不同成熟阶段的体细胞胚对冷冻胁迫的耐受性并不一致。较不成熟的胚通常在冷冻保存后维持了更好的结构组织性，组织破坏较少，暗化区域较少，同时还可见保存较好的原胚（pro-embryos）以及与原胚性区域相联系的冷冻保护剂覆盖层。相比之下，更成熟的胚往往呈现更深颜色与更明显结构损伤。该结果支持了异步胚簇中“较幼嫩胚更耐冷冻”的判断，提示胚性材料的发育状态是决定保存成功率的重要生物学变量。
在“透射电子显微镜超微结构分析”部分，研究人员显示，冷冻损伤主要表现为细胞组织结构紊乱，包括细胞核不对称、核膜改变、大液泡形成以及细胞壁受损和细胞间隙增大。这些特征提示细胞可能经历了明显的冷冻胁迫和自噬样变化。与此相对，存活细胞则保持较完整的细胞核形态、连续且组织良好的细胞壁，并具有更紧密的细胞排列和较小的细胞间隙。该部分结果表明，不同处理所提供的保护程度会直接反映在细胞超微结构完整性上，而较高存活率处理与更好的细胞结构保持状态相关。
在“EDS元素分析”部分，研究通过能量色散X射线能谱比较不同处理的元素信号强度，发现未冷冻对照具有最高的碳信号强度，超过15 Counts Per Second（CPS）；15% DMSO冷冻处理虽经历冷冻，但仍保持相对较高的碳强度，超过14 CPS；而0% DMSO处理碳强度降低至约12 CPS。氧信号也呈现类似趋势：对照最高，15% DMSO次之，0% DMSO最低。研究据此指出，较高碳信号强度与较高复温后存活率相关，而较低碳信号强度则与存活下降相关。此外，Zn和K在两种冷冻处理中均高于未冷冻对照，反映出冷冻胁迫条件下细胞离子分布或膜完整性可能发生变化。该部分结果从元素水平补充证明了不同冷冻保护条件对组织状态的影响。
在“组织学与再生发育表现”部分，甲苯胺蓝染色显示，对照体细胞胚具有清晰的原表皮（protoderm）、基本分生组织（ground meristem）和原形成层（procambium）分层结构，这是胚性发育正常的重要形态基础。冷冻处理后的体细胞胚则可见较强紫色染色，研究认为这可能与花青素积累相关，并伴有组织氧化形成的暗色区域，提示超低温处理诱导了明显生理胁迫。尽管如此，胚仍能顺利萌发，并进一步形成形态正常的幼苗，最终完成离体驯化。该结果表明，在优化条件下，冷冻保存并未阻断体细胞胚向完整植株的再生潜力。
讨论部分集中说明了DMSO与玻璃化体系在保护机制上的意义。研究认为，冷冻保存成功依赖于胚性材料发育阶段以及冻结前化学脱水效率。DMSO作为可渗透型冷冻保护剂，能够调节冰形成、降低共晶结晶风险并通过影响膜通透性改善渗透平衡，因此其浓度依赖性效应与本研究观察结果一致。论文进一步指出，冰晶形成是冷冻损伤的核心原因之一，DMSO可通过改变水分子构型以及水-脂双层界面理化性质，减轻界面张力和渗透冲击，从而有助于维持细胞结构完整性。另一方面，尽管滴液玻璃化常被认为可通过超快速降温提高再生率，但在巴西棕榈体细胞胚中，两种玻璃化方式并未表现出显著差异，这凸显了建立物种特异性方案的重要性。研究还指出，观察到的结构坍塌、液泡化与组织局部损伤，说明保护作用虽有效但在组织内部分布并不完全均一；而较幼嫩胚的更高耐受性则进一步强调了胚成熟度调控的价值。
研究结论部分可译为：研究成功建立了基于玻璃化的巴西棕榈体细胞胚冷冻保存体系。常规玻璃化法与滴液玻璃化法均可支持复温后恢复，但再生效率受DMSO浓度影响，其中10%和15% DMSO可获得更高再生率。对未添加DMSO与添加15% DMSO冷冻处理的胚进行超微结构比较表明，两者在细胞保存状态上存在差异，较高存活处理表现出更好的结构组织性。超微结构分析显示细胞保存具有处理依赖性差异，EDS分析则揭示不同冷冻保存处理间存在元素谱变化。综合来看，这些结果建立了巴西棕榈长期异地保存的可重复技术方案，并为该大西洋森林物种遗传资源保护提供了支持。
