洋地黄毒苷衍生物 BD-8 减轻 LPS 诱导实验模型中氧化应激与神经炎症

《Cell Biochemistry and Biophysics》：Digoxin Derivative BD-8 Attenuates Oxidative Stress and Neuroinflammation in an LPS-Induced Experimental Model

　　

摘要：慢性神经炎症通过氧化应激及炎性介质导致神经元损伤，提示亟需新型治疗策略。本研究评估了洋地黄毒苷（digoxin）衍生强心甾类（cardiotonic steroid, CTS）化合物 BD-8 的体外细胞毒性及体内神经保护作用。BD-8 细胞毒性低于 digoxin：在 SH-SY5Y 细胞中 CC50为 7.4 μM，在 BV-2 细胞中 CC50为 8.5 μM，而 digoxin 在 SH-SY5Y 细胞中 CC50为 33 nM。体内实验中 BD-8 未改变心、肝、肾功能生化标志物，支持其全身安全性。旷场实验（open-field test）中，BD-8 预防了 LPS 诱导的运动功能障碍，0.56 mg/kg（62.07 ± 3.269；P < 0.05）和 1.12 mg/kg（66.31 ± 5.282；P < 0.001）剂量组穿越总次数较 LPS 组显著增加。BD-8 还降低皮层脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）水平——0.56 mg/kg（14.38 ± 0.5568；P < 0.001）和 1.12 mg/kg（13.94 ± 0.8372；P < 0.001），海马区 1.12 mg/kg（14.04 ± 0.5223；P < 0.001）。此外，BD-8 调节皮层和海马抗氧化酶——超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）活性，并降低两脑区白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）水平，但不改变脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）水平。上述结果表明 BD-8 是神经炎症性疾病的有前景候选化合物。

论文解读：Digoxin Derivative BD-8 Attenuates Oxidative Stress and Neuroinflammation in an LPS-Induced Experimental Model

该论文发表于《Cell Biochemistry and Biophysics》。

研究背景与目的

慢性神经炎症通过小胶质细胞和星形胶质细胞持续活化，产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）及促炎细胞因子，参与阿尔茨海默病等神经退行性疾病进展。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的神经炎症模型可模拟外周炎症引发的中枢氧化损伤与疾病行为（sickness behavior）。经典强心甾类（cardiotonic steroids, CTSs）如地高辛（digoxin）和哇巴因（ouabain）是 Na⁺/K⁺-ATP酶（Na⁺/K⁺-ATPase, NKA）配体，除离子泵功能外还可经 NKA 信号平台调控炎症与氧化应激，但 digoxin 治疗窗窄、神经毒性大。研究人员前期开发了 digoxin 苄烯衍生物 BD-8，选择性作用于 NKA α2 亚型并在外周具抗炎活性，但其对中枢神经系统（central nervous system, CNS）作用未知。本研究旨在探讨 BD-8 在 LPS 诱导神经炎症与氧化应激实验模型中的神经保护效应及安全性。

主要关键技术方法概述

研究人员采用 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞与 BV-2 小鼠小胶质细胞进行 MTT 法细胞活力/细胞毒性（CC₅₀/CC₂₀）检测；选用雄性 Wistar 大鼠行腹腔注射 BD-8 连续 3 日进行全身毒性/血浆生化（AST、ALT、CK-MB、LDH 等）及心脏 NKA 活性评估；选用雄性 Swiss 小鼠设对照组、LPS（1 mg/kg,i.p.）组及 BD-8 预处理（0.28、0.56、1.12 mg/kg,i.p.）组，LPS 注射 4 h 后行旷场实验（open-field test）评价运动与探索行为，24 h 后取全皮层（total cortex）与海马（hippocampus）制备匀浆；检测指标包括硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS）即脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）/丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，SOD、CAT、GPx 抗氧化酶活性，以及皮层和海马 IL-6 与 BDNF 蛋白水平（ELISA 法）；数据以单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Tukey 事后检验处理。

研究结果

Cell Cytotoxicity（细胞毒性）

研究人员以 MTT 法检测发现，digoxin 对 SH-SY5Y 细胞 CC₅₀为 33 nM，而 BD-8 在 SH-SY5Y 细胞中 CC₅₀为 7.4 μM（CC₂₀5.3 μM），在 BV-2 细胞中 CC₅₀为 8.5 μM（CC₂₀7.0 μM），表明 BD-8 细胞毒性显著低于母体 digoxin，具备更宽的安全浓度范围。

BD8 Exerted an Increased Effect on Total Exploration in the Open Field Test（BD-8 增加旷场实验中总探索活动）

研究人员对 Wistar 大鼠连续 3 日给予 BD-8（20~400 μg/kg,i.p.），旷场实验显示各剂量组穿越方格总数、中央区进入次数及直立（rearing）次数均显著高于溶媒对照组，提示 BD-8 促进探索行为并具潜在抗焦虑样表型，且无明显全身毒性。

BD8 Presents a Systemic Biological Safety Effect in the Blood Markers（BD-8 对血液标志物具全身生物安全性）

研究人员检测 BD-8 处理大鼠血浆，发现总蛋白、葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、乳酸、胆红素、AST、ALT、CK-MB、LDH 均与对照组无差异，表明 BD-8 在测试剂量下不影响心、肝、肾功能生化指标，全身安全性良好，区别于 oleandrin 等具心脏毒性的 CTSs。

BD8 prevents LPS-Induced Impairment of Locomotor Behavior（BD-8 预防 LPS 诱导的运动行为受损）

研究人员在 Swiss 小鼠中先给 BD-8 再给 LPS（1 mg/kg,i.p.），LPS 组 4 h 后穿越次数较对照组下降约 74.77%、中央区停留时间减少约 83%；BD-8 0.56 mg/kg（P < 0.05）和 1.12 mg/kg（P < 0.001）显著恢复穿越次数，0.28、0.56、1.12 mg/kg 均显著增加中央区停留时间（分别 P < 0.05、P < 0.05、P < 0.01），说明 BD-8 减轻 LPS 诱导的疾病行为/运动抑制。

BD8 Reduces Lipid Peroxidation (LPO) Levels（BD-8 降低脂质过氧化水平）

研究人员检测发现 LPS 使皮层和海马 LPO（MDA nmol/mg protein）分别升高 63.1% 和 76.3%；BD-8 0.28、0.56、1.12 mg/kg 均显著降低皮层 LPO（P < 0.01 或 P < 0.001），1.12 mg/kg 显著降低海马 LPO（P < 0.001），表明 BD-8 抑制 LPS 诱导的脑脂质过氧化损伤。

BD8 Modulates Antioxidant Enzyme Activities（BD-8 调节抗氧化酶活性）

研究人员测定发现 LPS 降低皮层和海马 SOD、CAT、GPx 活性；BD-8 0.56 和 1.12 mg/kg 在皮层及海马均显著回升三种酶活性（SOD：皮层 P < 0.05/P < 0.01，海马 P < 0.01/P < 0.001；CAT 与 GPx 呈类似趋势），提示 BD-8 恢复 LPS 抑制的抗氧化防御系统。

Effects of BD-8 on mice brain IL-6 and BDNF protein levels（BD-8 对小鼠脑 IL-6 和 BDNF 蛋白水平的影响）

研究人员以 ELISA 检测发现 LPS 升高皮层和海马 IL-6；BD-8 0.56 mg/kg 显著降低皮层 IL-6（P < 0.05），0.56 和 1.12 mg/kg 显著降低海马 IL-6（均 P < 0.05）。各剂量组 BDNF 蛋白水平与 LPS 组无显著差异，表明 BD-8 主要通过抑制神经炎症而非上调 BDNF 发挥早期保护。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，传统 CTSs 因毒性限制临床应用，而 BD-8 经苄烯修饰降低细胞毒性并保持 NKA α2 亚型选择性。BD-8 不改变心肝肾血浆标志物及心肌 NKA 活性和心脏氧化应激，全身安全性优于 digoxin 及 oleandrin。在 LPS 模型中 BD-8 改善运动/探索行为，伴随皮层与海马 LPO 降低、SOD/CAT/GPx 活性恢复及 IL-6 下调，但 BDNF 未变，提示其机制主要为抑制 NKA 介导的炎症与氧化信号而非神经营养因子通路调控。先前研究表明 BD-8 在外周巨噬细胞中下调 iNOS 及 NF-κB p65、ERK、p38 磷酸化，本研究首次证实其透过血脑屏障或作用于脑内靶点减轻 CNS 神经炎症与氧化损伤。

Conclusion（结论）

综合上述结果，BD-8 可减轻 LPS 诱导的神经行为障碍，其行为改善伴随炎症与氧化应激相关参数调节——包括降低 IL-6 水平及改变抗氧化酶活性——支持 BD-8 作为神经炎症性疾病的有前景候选化合物。