通过体外筛选、气相色谱–质谱(GC–MS)成分分析和分子对接方法发现根结线虫(Meloidogyne spp.)细菌源生物杀线虫剂

《Chemical and Biological Technologies in Agriculture》：Discovery of bacterial-derived bio-nematicides against root-knot nematodes through in vitro screening, GC–MS profiling, and molecular docking approaches

　　

摘要：根结线虫(Root-knot nematodes, Meloidogyne spp.)是危害全球番茄生产最具经济破坏性的病原物之一。本研究采用体外(in vitro)与计算机模拟(in silico)相结合的方法，评价细菌无细胞培养滤液(cell-free culture filtrates)对南方根结线虫(Meloidogyne spp.)的杀线虫潜力。研究人员从土壤中分离获得17株细菌，体外评估其对根结线虫卵孵化抑制及二龄幼虫(J2)死亡率的影响，并通过16S rRNA基因测序对活性最强的两株进行分子鉴定。采用气相色谱–质谱(GC–MS)分析其培养滤液中的生物活性化合物，并通过分子对接(molecular docking)将鉴定出的化合物与线虫乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)进行对接评估杀线虫潜力。体外结果表明，菌株BI-10对卵孵化抑制率最高(89.67%)，菌株BI-13对J2死亡率最高(80.91%)；BI-10鉴定为Stenotrophomonas beteli(登录号PX508182)，BI-13鉴定为Enterobacter quasihormaechei(登录号PX508183)。GC–MS共检出79种生物活性化合物，相对丰度0.52%～6.42%。分子对接显示6种化合物对线虫AChE的结合亲和力优于对照杀线虫剂oxamyl。研究结果表明BI-10和BI-13产生的次级代谢产物有望作为候选生物杀线虫剂(bio-nematicidal agents)，可作为化学杀线虫剂的可持续替代物，并为今后开发防治根结线虫的有效生物杀线虫剂提供依据。

论文解读：细菌源次生代谢产物对根结线虫的生物防治潜力——基于体外筛选、GC–MS及分子对接的综合研究

根结线虫（Meloidogyne spp.，RKNs）是危害全球蔬菜特别是番茄（Solanum lycopersicum L.）生产的最具破坏性的植物寄生线虫之一，可诱发根部虫瘿及巨细胞（giant cells, GCs）形成，阻碍水肥吸收并加重土传病害复合侵染，造成严重减产。目前生产上依赖化学杀线虫剂（如熏蒸剂及氨基甲酸酯类oxamyl等）进行防控，但此类药剂成本高、毒性大、环境残留风险高且与有机农业体系不相容，长期施用还易因微生物降解导致效果下降。因此，发掘低毒、环境友好的生物源杀线虫剂已成为植物保护领域的重要研究方向。植物根际促生菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）可产生多种次级代谢产物（secondary metabolites）、水解酶及挥发性有机物，已被证实对根结线虫具拮抗作用，但Stenotrophomonas beteli与Enterobacter quasihormaechei在此方面的应用尚鲜见报道。本文研究人员依托埃及曼苏拉大学，整合体外生物测定、气相色谱–质谱（gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS）化学成分分析及分子对接（molecular docking）、MM/GBSA结合自由能计算与ADMET（吸收、分布、代谢、排泄及毒性）预测，系统评价番茄根际分离细菌的无细胞培养滤液（bacterial culture filtrates, BCFs）及其所含化合物对Meloidogyne incognita的杀线虫活性，并以经典化学杀线虫剂oxamyl为参照探讨其作用靶点与潜力，研究成果发表于《Chemical and Biological Technologies in Agriculture》。

主要关键技术方法概述：

研究人员从埃及代盖赫利耶省感染根结线虫的番茄根际采集土样，经系列稀释法分离纯化17株细菌；制备无细胞培养滤液（经0.22 μm滤膜除菌）并进行体外卵孵化抑制与J2死亡率测定，以Abbott公式校正死亡率；筛选出活性最高的BI-10与BI-13，通过16S rRNA基因PCR扩增及Sanger测序进行分子鉴定并构建系统发育树；对两株优选菌的培养滤液进行GC–MS检测以鉴定生物活性成分；以AlphaFold预测Meloidogyne incognita乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE；UniProt O96529）三维结构并经ModRefiner优化与PROCHECK拉氏图验证，采用Schr?dinger Suite依次进行HTVS（high-throughput virtual screening）→SP（standard precision）→XP（extra precision）分层对接筛选，对优选配体进行MM/GBSA结合自由能计算及SwissADME与ProTox 3.0在线ADMET预测；体外数据采用单因素方差分析与Tukey HSD多重比较（p＜0.05）。

研究结果

Nematocidal activity of bacterial culture filtrates (BCFs) against Meloidogyne spp. under in vitro conditions

体外测定17株细菌无细胞培养滤液对Meloidogyne spp.卵孵化及J2存活的影响。结果显示BI-10平均孵化卵数最低（3.11枚），卵孵化抑制率达89.67%，显著高于其余处理；BI-13虽孵化抑制率为80.84%，但对J2致死率最高，达80.91%（平均死亡J2数81.55条），其次为BI-15（80.46%）与BI-16（75.86%）。表明不同菌株对线虫不同生活阶段具选择性抑制优势。

Molecular identification of bacterial isolates

基于体外活性优选BI-10与BI-13进行16S rRNA基因序列比对，BI-10与Stenotrophomonas beteli（NR_040804）同源性98.62%，BI-13与Enterobacter quasihormaechei（NR_180451）同源性99.77%，系统发育树支持其分类地位。两菌株分别提交GenBank获登录号PX508182（Stenotrophomonas beteli strain SEPA-E）与PX508183（Enterobacter quasihormaechei strain SEPA-K），系首次报道其对根结线虫的生物防治潜力。

GC–MS analysis

对BI-10与BI-13培养滤液进行GC–MS分析，共鉴定79种生物活性化合物，相对丰度0.52%～6.42%。BI-10滤液以脂肪酸衍生物及脂质相关化合物为主，如亚油酸乙酯（linoleic acid ethyl ester）与十六烷酸衍生物；BI-13滤液以不饱和脂肪酸为主，尤以9-十八碳烯酸（9-octadecenoic acid，即油酸）为主要成分。约17%的化合物为两菌共有，逾47%为菌株特有，提示菌株代谢谱差异可能影响杀线虫谱。

Computational exploration of potential nematocidal activity

以线虫AChE为靶点，经ModRefiner优化后拉氏图显示91.0%残基位于最有利区，模型可靠。对79个GC–MS鉴定化合物经HTVS→SP→XP三级对接筛选，最终6个分子满足XP对接分值≤－7.00 kcal·mol^－1且与AChE形成≥2个显著相互作用的标准，按结合能排序为LIG-2（－9.135 kcal·mol^－1）＞LIG-30（－8.453 kcal·mol^－1）＞LIG-62（－8.262 kcal·mol^－1）＞LIG-15（－7.916 kcal·mol^－1）＞LIG-65（－7.513 kcal·mol^－1）＞LIG-21（－7.184 kcal·mol^－1），均优于对照oxamyl（－3.749 kcal·mol^－1，仅与Ala338形成一个氢键）。6个分子分别与AChE活性口袋残基形成氢键（如Asp113、Tyr115、Ala338、Gln385等）及π–π堆积作用（Trp164、Trp331、Phe340、Tyr384、Phe381等）。MM/GBSA计算所得结合自由能ΔG_bind介于－71.71（LIG-15）至－44.35 kcal·mol^－1（LIG-65），与XP分值呈良好对应关系。ADMET预测显示6个先导分子均符合Lipinski五规则（Lipinski's rule of five），具良好水溶性、适宜拓扑极性表面积（TPSA）与脂水分配系数（Consensus Log P 0.51～4.99），无明显肝毒性、致癌性及高口服毒性风险，具备作为环境友好型杀线虫先导物的潜质。

讨论与结论总结

研究人员指出，BI-10（Stenotrophomonas beteli SEPA-E）与BI-13（Enterobacter quasihormaechei SEPA-K）无细胞培养滤液分别对根结线虫卵孵化及J2具显著抑制作用，其活性可能与菌株产生的脂肪酸衍生物、不饱和脂肪酸及其他次生代谢产物有关。计算机模拟证实其中6种GC–MS鉴定成分可通过氢键及π–π堆积强效结合线虫AChE催化/活性中心周边残基，结合亲和力优于常用氨基甲酸酯类杀线虫剂oxamyl，且具良好药代/毒理预测特征。Stenotrophomonas属与Enterobacter quasihormaechei在根结线虫生物防治中的应用属首次报道。研究亦指出局限：所用为混合无细胞滤液而非单体纯化化合物，无法排除协同效应或单独归因；分子对接仅为理论预测，尚未验证AChE实际酶活抑制；缺乏温室及田间试验佐证。未来需开展单体化合物分离纯化、AChE酶学抑制实验及温室—大田效力评价以推进生物杀线虫制剂开发。

综上，Stenotrophomonas beteli strain SEPA-E（GenBank PX508182）与Enterobacter quasihormaechei strain SEPA-K（GenBank PX508183）或其培养滤液所含次级代谢产物在体外对Meloidogyne incognita具显著卵孵化抑制与J2致死作用，其中6种GC–MS鉴定成分可高效结合线虫乙酰胆碱酯酶（AChE），结合能优于oxamyl，且in silico ADMET预测符合绿色农药要求，有望开发为根结线虫可持续防控的新型生物杀线虫剂（bio-nematicides），但仍需温室及田间试验进一步验证。