《Journal of Cell Communication and Signaling》：Ceramide-mediated mitochondrial dysfunction in nonobese nonalcoholic fatty liver disease: A regulatory role for serine palmitoyltransferase subunit 2
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本研究探讨了丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱基亚基2（Sptlc2）-神经酰胺轴在非肥胖非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的病理相关性，重点关注肝脂肪变性、炎症、氧化应激和线粒体功能障碍。研究人员采用高温干炒大豆饲料建立非肥胖NAFLD大鼠模型。使用基于液相色谱-质谱
本研究探讨了丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱基亚基2（Sptlc2）-神经酰胺轴在非肥胖非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的病理相关性，重点关注肝脂肪变性、炎症、氧化应激和线粒体功能障碍。研究人员采用高温干炒大豆饲料建立非肥胖NAFLD大鼠模型。使用基于液相色谱-质谱（LC-MS）的整合蛋白质组学和代谢组学分析来识别候选通路。通过AAV2/8介导的肝脏定向敲低（体内）、慢病毒敲低（原代肝细胞）以及C2-神经酰胺拯救实验验证Sptlc2功能。多组学分析将Sptlc2鉴定为该模型中与鞘脂代谢相关的候选分子。Sptlc2敲低减少了长链神经酰胺积累、肝脏脂质沉积、炎症细胞因子表达、氧化应激和肝细胞损伤。在原代肝细胞中，Sptlc2沉默改善了线粒体呼吸、膜电位、钙和活性氧（ROS）稳态以及线粒体超微结构。这些保护作用在体外和体内被C2-神经酰胺部分逆转。Sptlc2-神经酰胺轴促进了该非肥胖NAFLD模型中的神经酰胺积累、肝脏脂毒性、炎症激活和线粒体功能障碍，提示其作为进一步研究治疗靶点的潜在相关性。
**论文解读：Sptlc2-神经酰胺轴在非肥胖非酒精性脂肪性肝病中的病理作用**
**研究背景与问题**
非肥胖非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在亚洲人群中日益受到关注，其特征是尽管体质指数（BMI）处于非超重范围，但仍出现肝脂肪变性、炎症甚至纤维化进展。由于传统代谢风险特征不明显，非肥胖NAFLD在临床实践中常被低估。目前，其脂毒性损伤的分子基础尚不完全明确，且与肥胖NAFLD的异同点尚未直接建立。脂毒性是NAFLD进展的核心过程，与游离脂肪酸（FFA）及其生物活性脂质衍生物的肝脏积累密切相关，其中神经酰胺因参与胰岛素抵抗、炎症信号和线粒体损伤而备受关注。然而，在非肥胖NAFLD中，神经酰胺合成失调是否为病理变化的主要驱动因素，以及该过程是否与特定分子轴相关，直接证据仍然有限。丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱基亚基2（Sptlc2）是神经酰胺从头合成途径的关键酶组分，在肥胖或高脂饮食相关的代谢疾病中，其上调与神经酰胺积累、肝细胞功能障碍、炎症激活和线粒体损伤相关，但该通路在非肥胖NAFLD中是否同样发挥作用尚未明确。
**研究内容与结论**
为填补上述空白，研究人员利用高温干炒大豆（DFS）诱导的非肥胖NAFLD大鼠模型，聚焦三个未解决问题：非肥胖NAFLD中肝损伤的脂毒性驱动因素特征不足；神经酰胺从头合成是否为该模型中神经酰胺失调的主要来源；Sptlc2与神经酰胺积累、线粒体功能障碍、炎症反应和肝细胞损伤的功能关联尚未系统检验。通过整合代谢组学和蛋白质组学分析，结合体内外功能实验，研究人员评估了Sptlc2与鞘脂失调的关联，并验证了Sptlc2-神经酰胺通路在DFS模型中的功能意义。研究发现，Sptlc2-神经酰胺轴驱动了该模型中的神经酰胺积累、肝脏脂毒性、炎症激活和线粒体功能障碍，提示其作为进一步研究治疗靶点的潜在相关性。该论文发表在《Journal of Cell Communication and Signaling》。
**主要关键技术方法**
研究采用的关键技术方法包括：基于液相色谱-质谱（LC-MS）的整合蛋白质组学和代谢组学分析，用于识别候选通路；重组腺相关病毒血清型2/8（AAV2/8）介导的肝脏定向基因敲低（体内）和慢病毒介导的基因敲低（原代大鼠肝细胞）；C2-神经酰胺拯救实验；Seahorse XFe分析仪检测线粒体耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构。临床样本队列来源：来自山东第一医科大学附属济南市中心医院的9例非肥胖NAFLD患者和9例非肥胖健康对照的血清样本。
**研究结果**
**3.1 DFS模型中鞘脂失调与Sptlc2提名**：通过多组学分析，在DFS组肝脏中检测到145种差异代谢物和52种差异表达蛋白，通路富集分析显示脂质代谢相关通路改变。将差异表达蛋白与GeneCards数据库的鞘脂代谢基因集取交集，获得三个候选分子（Becn1、Sptlc2、Pdxk），其中Sptlc2在DFS组中显著上调（p<0.05），提示其参与鞘脂相关分子改变。
**3.2 Sptlc2敲低后体外和体内的长链神经酰胺变化**：LC-MS/MS分析显示，DFS组血清和肝脏中总神经酰胺及多种长链神经酰胺种类（包括Cer(d18:1/14:0)、Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)和Cer(d18:1/24:0)）均升高（p<0.001）；临床非肥胖NAFLD患者血清中多种长链神经酰胺也升高（p<0.05）。在原代肝细胞和体内DFS模型中，Sptlc2敲低显著降低了多种长链神经酰胺水平（p<0.01），其中Cer(d18:1/16:0)和Cer(d18:1/18:0)变化尤为显著（p<0.001），证实Sptlc2丰度与长链神经酰胺水平相关。
**3.3 肝脏定向敲低后肝细胞相关Sptlc2信号、组织损伤和炎症**：在DFS大鼠中，Sptlc2敲低后，肝细胞核因子4α（HNF4α）阳性肝细胞中Sptlc2荧光强度降低（p<0.001），H&E染色显示肝细胞空泡变性、肝索紊乱和炎症浸润减轻，组织学损伤评分降低（p<0.001）；TUNEL阳性细胞减少，cleaved-caspase-3活性降低（p<0.001）；F4/80免疫荧光显示巨噬细胞浸润减少（p<0.001）；炎症相关转录本TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（p<0.001），表明Sptlc2信号变化与组织损伤、凋亡和炎症表型相关。
**3.4 Sptlc2敲低后的肝脏脂毒性和氧化应激**：Sptlc2敲低后，DFS组肝脏甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）含量降低（p<0.001），Oil Red O染色显示脂滴积累减少（p<0.001）；氧化应激指标中，丙二醛（MDA）降低，谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）升高（p<0.01），表明Sptlc2敲低减轻了肝脏脂毒性和氧化应激。
**3.5 C2-神经酰胺对肝细胞损伤的功能拯救**：在原代肝细胞中，棕榈酸（PA）处理诱导脂毒性损伤，Sptlc2敲低后ROS、脂滴积累、乳酸脱氢酶（LDH）释放和TUNEL阳性率降低，凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和BAX下调、Bcl-2上调（p<0.001）；C2-神经酰胺处理部分逆转了这些保护效应（p<0.001），表明Sptlc2敲低的保护作用依赖于神经酰胺水平。
**3.6 神经酰胺相关的线粒体稳态和超微结构变化**：在原代肝细胞中，PA处理导致胞质Ca
2+和ROS升高、OCR降低、ECAR升高、线粒体膜电位（ΔΨm）降低、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放增加、电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）寡聚化增强（p<0.01）；Sptlc2敲低部分恢复这些参数，C2-神经酰胺处理使其向损伤方向逆转（p<0.001）。TEM显示PA诱导线粒体肿胀、嵴破坏和空泡变性，Sptlc2敲低减轻这些改变，C2-神经酰胺再次加重，表明Sptlc2-神经酰胺轴参与线粒体功能紊乱。
**3.7 体内C2-神经酰胺对肝损伤和脂毒性的拯救**：在DFS大鼠中，Sptlc2敲低后给予C2-神经酰胺，H&E染色显示肝细胞空泡变性、炎症浸润和组织结构紊乱加重，组织学损伤评分升高（p<0.001）；Oil Red O染色显示脂滴积累增加（p<0.001）；TUNEL阳性细胞和caspase-3活性升高（p<0.001）；F4/80阳性面积增加（p<0.001）；炎症转录本TNF-α、IL-1β和IL-6升高（p<0.001）；GSH和SOD降低、MDA升高（p<0.001），与体外结果一致，支持神经酰胺下游效应在该表型中的作用。
**讨论与结论**
讨论部分指出，DFS模型维持非肥胖表型但出现肝脏脂质积累、炎症和神经酰胺相关代谢异常，多组学分析支持其用于研究非肥胖条件下脂肪肝的实用性。神经酰胺积累与脂毒性、炎症和肝细胞损伤广泛相关，本研究中DFS模型血清和肝脏总神经酰胺及长链神经酰胺升高，临床数据也显示一致变化，表明神经酰胺失调也存在于非肥胖背景。Sptlc2敲低减少长链神经酰胺、减轻组织损伤、炎症和脂毒性，C2-神经酰胺部分逆转这些效应，支持Sptlc2-神经酰胺轴的功能关联。线粒体功能障碍是NAFLD进展的核心事件，本研究中PA处理诱导线粒体稳态破坏，Sptlc2敲低改善，C2-神经酰胺逆转，提示神经酰胺积累与线粒体稳态丧失和肝细胞损伤相关。研究局限性包括：缺乏肥胖诱导饮食对照以评估疾病特异性；缺乏肝脏组织水平的超微结构验证；体内敲低数据虽支持肝细胞靶向，但缺乏系统性细胞类型特异性验证；体外敲低效果中等；临床队列较小且年龄性别不均衡；C2-神经酰胺作为功能拯救条件不能完全代表内源性长链神经酰胺。
**研究结论**：在DFS诱导的非肥胖NAFLD模型中，整合蛋白质组学和代谢组学分析将Sptlc2鉴定为与鞘脂失调相关的候选调控因子。Sptlc2表达升高伴随长链神经酰胺积累、肝脏脂毒性损伤、炎症激活和线粒体功能损伤。功能实验进一步表明，Sptlc2敲低减少神经酰胺积累、脂质沉积、氧化应激、炎症反应和肝细胞损伤，而C2-神经酰胺拯救部分逆转这些变化。这些发现支持Sptlc2-神经酰胺轴在该模型病理变化中的功能作用。本研究扩展了非肥胖NAFLD的机制框架，提示Sptlc2-神经酰胺通路可能作为进一步研究的潜在靶点。
