产毒素脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis toxin, BFT)促进小鼠胆囊癌(Gall Bladder Cancer, GBC)发生发展

《Nature Microbiology》：Bacteroides fragilis toxin promotes gall bladder cancer in mice

　　

产肠毒素脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF)可分泌脆弱拟杆菌毒素(B. fragilis toxin, BFT)，既往与结直肠癌相关，且在胆囊癌(Gall Bladder Cancer, GBC)患者中有富集现象。研究人员通过分析患者样本证实ETBF在GBC肿瘤中富集，并可在小鼠胆囊内定植；体外实验及患者来源类器官(organoid)实验显示ETBF促进GBC细胞增殖；在小鼠GBC异种移植模型中，ETBF以BFT依赖的方式促进肿瘤生长。机制上，BFT的致瘤活性依赖于ETBF表面蛋白——膜结合裂解性胞壁质转糖基酶D(membrane-bound lytic murein transglycosylase D, MltD)，其可与宿主受体——跨膜丝氨酸蛋白酶13(transmembrane serine protease 13, TMPRSS13)相互作用，激活Janus激酶2–信号转导与转录激活因子3(Janus kinase 2–signal transducer and activator of transcription 3, JAK2–STAT3)信号通路从而促进肿瘤发生；BFT还可激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号，上调C-X-C基序趋化因子配体1(C-X-C motif chemokine ligand 1, CXCL1)分泌，导致髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)招募及肿瘤微环境(tumour microenvironment, TME)中血管生成。上述发现揭示了ETBF通过宿主–病原体互作及微环境重塑促进GBC发展的双重机制，并为限制GBC进展提供了潜在治疗靶点。

论文解读：《Bacteroides fragilis toxin promotes gall bladder cancer in mice》（发表于Nature Microbiology）

一、研究背景与立项依据

胆囊癌（Gall Bladder Cancer, GBC）是胆道系统最具侵袭性的恶性肿瘤，预后极差，缺乏有效治疗手段，其分子机制尚未阐明。近年研究发现胆道微生物组是胆道疾病的重要环境因素，约15–20%的癌症与微生物病原体相关。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）是人肠道常见共生菌，其中产肠毒素亚型（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF）分泌脆弱拟杆菌毒素（B. fragilis toxin, BFT），已在结直肠癌中被证实具促瘤作用，且临床证据显示B. fragilis在GBC组织中富集，但ETBF是否及如何促进GBC发生发展尚不清楚。本研究旨在明确ETBF在GBC中的富集特征、促瘤功能及分子机制。

二、主要关键技术方法

研究人员收集25例GBC患者肿瘤及配对癌旁组织、慢性结石性胆囊炎（chronic calculous cholecystitis, CCC）及癌前病变组织进行宏基因组鸟枪测序（metagenomic shotgun sequencing）与荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）；采用RT-qPCR、多重免疫荧光分析ETBF空间分布；建立C57BL/6小鼠经口灌胃ETBF定植模型评估胆囊屏障与胆汁酸代谢（液相色谱–串联质谱 LC–MS/MS）；用NOZ及GBC-SD细胞系、人源GBC类器官（patient-derived organoid）与ETBF/非产毒脆弱拟杆菌（Non-enterotoxigenic Bacteroides fragilis, NTBF）及△bft、△mltD突变株共培养，检测增殖（CCK-8）、克隆形成、Transwell迁移侵袭及上皮–间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）标志物；建立BALB/c裸鼠NOZ细胞皮下异种移植模型行瘤内注射细菌或重组BFT（recombinant BFT, rBFT）；通过生物素pull-down联合质谱、GST pull-down、far western blot及Co-免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, co-IP）鉴定ETBF表面黏附蛋白MltD与宿主受体TMPRSS13（transmembrane serine protease 13）互作；用CRISPR–Cas9敲除TMPRSS13验证功能；RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析差异基因与KEGG通路；细胞因子/趋化因子抗体芯片与ELISA检测CXCL1；流式细胞术分析肿瘤内髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cell, MDSC, CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺）；免疫组化检测Ki-67与CD31评估增殖与血管生成；用NF-κB抑制剂JSH-23及抗Gr-1抗体、贝伐珠单抗（bevacizumab）进行体内干预。

三、研究结果

B. fragilis is enriched in gall bladder tumour tissue compared with para-tumour tissue

对25例GBC患者肿瘤（T）与配对癌旁（PT）组织宏基因组测序发现B. fragilis在肿瘤中显著富集，GBC组高于CCC组；RT-qPCR与ETBF特异性探针FISH证实ETBF在肿瘤及癌前病变中定植率升高，且主要定位于胆囊黏膜靠近肿瘤细胞区，提示ETBF可能在GBC早期参与发病。

ETBF impairs gall bladder barrier function and bile acid homeostasis in mice

C57BL/6小鼠经口灌胃ETBF 6周后可于胆囊黏膜定植并检出bft基因；Western blot显示紧密连接蛋白E-cadherin、Claudin-3、Occludin、ZO-1下调，提示ETBF破坏胆囊上皮屏障；LC–MS/MS显示胆汁酸谱重塑，初级胆汁酸合成通路激活。

ETBF promotes GBC growth both in vitro and in vivo

ETBF而非NTBF显著促进NOZ、GBC-SD细胞增殖及患者来源类器官扩增，增强克隆形成、迁移与侵袭能力，下调上皮标记物、上调间质标记物（Vimentin、N-cadherin）；裸鼠皮下移植瘤瘤内注射ETBF加速肿瘤生长、增加重量并提高Ki-67⁺指数。

BFT is required for the tumour-promoting effects of ETBF

构建ETBF △bft缺失株，其丧失促GBC细胞增殖、类器官生长促进、克隆形成、迁移侵袭及体内成瘤能力，证明BFT是ETBF促瘤的关键毒力因子。

BFT alone is insufficient to directly promote GBC cell proliferation

ETBF条件培养基（ETBF-CM）及重组rBFT不能单独促进GBC细胞增殖，虽具E-cadherin切割活性，提示BFT需完整细菌或微环境协同发挥促瘤作用。

ETBF preferentially interacts with GBC cell lines via surface protein MltD

ETBF对GBC细胞黏附强于正常胆囊上皮细胞（L-2F7），不侵入胞内；biotin pull-down与质谱鉴定ETBF表面膜蛋白MltD为候选黏附素；构建ETBF △mltD及回补株，△mltD黏附能力与体内促瘤能力显著减弱，回补后恢复，表明MltD介导ETBF对GBC细胞的特异性黏附与促瘤。

ETBF surface protein MltD binds to TMPRSS13 on GBC cells

GST pull-down与co-IP鉴定宿主跨膜受体TMPRSS13与MltD直接互作；TMPRSS13在GBC细胞中高表达，CRISPR–Cas9敲除TMPRSS13削弱ETBF黏附与体内促瘤，回补TMPRSS13恢复表型，证实MltD–TMPRSS13轴为ETBF定植与促瘤所必需。

BFT enhanced MltD–TMPRSS13-dependent adhesion by upregulating TMPRSS13

BFT通过激活NF-κB p65入核结合TMPRSS13启动子p65结合位点，上调TMPRSS13蛋白表达从而增强MltD–TMPRSS13介导的黏附；NF-κB抑制剂JSH-23可逆转此效应。

ETBF activates the JAK2–STAT3 signalling pathway via the BFT–MltD–TMPRSS13 axis

RNA-seq显示ETBF处理上调JAK–STAT通路基因；Western blot证实ETBF诱导JAK2（Tyr¹⁰⁰⁷）与STAT3（Tyr⁷⁰⁵）磷酸化，该激活依赖BFT、MltD及宿主TMPRSS13（△bft/△mltD/TMPRSS13敲除均取消激活），而rBFT单独不激活JAK2–STAT3，说明完整细菌通过MltD–TMPRSS13–JAK2–STAT3轴促进癌细胞增殖。

ETBF promotes CXCL1 secretion to recruit MDSCs via the BFT–NF-κB–CXCL1 axis

细胞因子芯片筛选发现ETBF显著上调NOZ细胞CXCL1分泌，依赖BFT（△bft无此作用），rBFT可诱导CXCL1，被JSH-23阻断；体内ETBF处理增加移植瘤内MDSC（CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺）比例与CD31⁺微血管密度；rBFT单独瘤内注射也增加MDSC招募与血管生成、促进肿瘤生长；MDSC条件培养基促进人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）成管，可被抗VEGF抗体（bevacizumab）抑制；体内清除MDSC或贝伐珠单抗可逆转BFT促瘤效应，证明BFT通过NF-κB–CXCL1招募MDSC并诱导VEGF依赖性血管生成重塑TME。

四、讨论与结论总结（翻译并浓缩）

研究证实ETBF是GBC重要的瘤内致病微生物，通过双重机制促瘤：（1）ETBF表面MltD与GBC细胞TMPRSS13结合，BFT上调TMPRSS13表达以增强黏附，该互作激活JAK2–STAT3信号促进癌细胞增殖；（2）ETBF分泌BFT激活NF-κB–CXCL1轴，招募MDSC并促进VEGF依赖的血管生成，间接塑造免疫抑制与促血管生成TME。ETBF定植伴随胆汁酸代谢紊乱可能进一步放大炎症与基因组不稳定性。TMPRSS13首次被鉴定为细菌黏附受体。临床层面，检测ETBF定植或阻断MltD–TMPRSS13互作、联合抗血管生成或MDSC清除策略具潜在诊疗价值。局限包括缺乏完全模拟人免疫微环境的原位自发GBC模型及BFT专属宿主受体未完全阐明。综上，ETBF通过BFT–MltD–TMPRSS13–JAK2–STAT3细胞自主途径及BFT–NF-κB–CXCL1–MDSC–血管生成非细胞自主途径协同促进GBC进展，为微生物靶向干预GBC提供理论与实验依据。