《Neurogastroenterology & Motility》：ReFerm? a Fermented Oat Gruel Composition, Improves Colonic Barrier Function and Modulates Tricellulin Expression in Patients With Irritable Bowel Syndrome
编辑推荐：
摘要（ABSTRACT）
背景（Background）：肠道屏障功能障碍被认为参与肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome, IBS）的病理生理过程，可导致肠通透性增加、低度炎症及症状产生。微生物来源制品已知可改善上皮屏障功能，但其分子机
摘要（ABSTRACT）
背景（Background）：肠道屏障功能障碍被认为参与肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome, IBS）的病理生理过程，可导致肠通透性增加、低度炎症及症状产生。微生物来源制品已知可改善上皮屏障功能，但其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨发酵燕麦稀粥制剂ReFerm?对IBS患者结肠屏障功能及紧密连接（Tight Junction, TJ）蛋白表达的影响。
方法（Methods）：将IBS患者结肠活检组织置于尤斯灌流室（Ussing chamber）中以评估ReFerm?对上皮通透性的直接作用。同时，分析经ReFerm?或安慰剂灌肠处理后的患者活检组织中多种TJ蛋白的表达水平——采用蛋白质免疫印迹法（Western Blotting, WB）及共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）。体外实验在Caco-2细胞中进行验证。
主要结果（Key Results）：与未刺激活检组织相比，直接向Ussing chamber中加入ReFerm?可降低旁细胞（paracellular）及穿细胞（transcellular）通透性。该效应伴随三细胞紧密连接（tricellular tight junction, tTJ）处TJ蛋白Tricellulin（MARVELD2基因编码）表达上调。Caco-2细胞体外实验支持上述发现，证实ReFerm?对上皮屏障特性有直接作用。
结论与推论（Conclusions and Inferences）：ReFerm?可增强IBS患者肠黏膜的结肠屏障完整性，其潜在机制可能为调控TJ蛋白Tricellulin。本研究为发酵燕麦干预制品（如ReFerm?）的屏障保护作用提供了机制层面的见解，并支持其在IBS中的潜在治疗价值。
论文解读：发酵燕麦制剂ReFerm?对IBS患者结肠屏障功能及Tricellulin表达的调控作用
该研究围绕肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome, IBS）患者存在的肠道屏障功能障碍展开。现有证据表明IBS患者存在肠上皮通透性增加及紧密连接（Tight Junction, TJ）蛋白表达或分布异常，允许腔内容物透过肠黏膜，诱发低度炎症与内脏高敏感。尽管益生菌/微生物代谢产物被报道可改善上皮屏障，但其作用于IBS患者结肠组织、特别是三细胞连接（tricellular tight junction, tTJ）处Tricellulin（三细胞紧密连接蛋白，MARVELD2编码）的具体机制尚未明确。ReFerm?系采用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum DSM 9843，即L. plantarum 299v）发酵燕麦基质所得的后生元（postbiotic）制品，含短链脂肪酸等代谢物。研究人员前期已发现其经灌肠给药可提升跨上皮电阻（Transepithelial Electrical Resistance, TER）并降低肥大细胞脱颗粒，但TJ蛋白层面机制不明。因此，本研究通过离体（ex vivo）、体内干预（灌肠）及体外（in vitro）Caco-2细胞模型，系统探究ReFerm?对IBS结肠屏障通透性及各TJ蛋白——Claudin-1、Occludin、Zonula Occludens-1（ZO-1）及Tricellulin——表达量与亚细胞定位的影响，以阐明其屏障保护机制。
研究人员纳入符合罗马IV标准的轻中度IBS患者（IBS-D腹泻为主型及IBS-M混合型），设两个队列：队列1（n=30，随机接受ReFerm?或增稠水安慰剂灌肠，每日2次×14天，干预前后分别取乙状结肠活检）用于WB及共聚焦分析；队列2（n=8，仅基线活检）用于Ussing chamber直接加药实验。关键技术方法包括：（1）尤斯灌流室（Ussing chamber）检测4 kDa FITC-葡聚糖（旁细胞通路）及辣根过氧化物酶Horseradish Peroxidase（HRP，44 kDa，穿细胞通路）的通透性，同步监测跨上皮电位差（Potential Difference, PD）、TER及短路电流（Short-circuit Current, Isc）；（2）蛋白质免疫印迹（Western Blotting, WB）定量TJ蛋白相对表达量，以β-肌动蛋白（β-Actin）为内参；（3）免疫荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy）定量tTJ处Tricellulin富集程度（tTJ/bTJ荧光强度比及Tricellulin阳性顶点百分比）；（4）Caco-2细胞分化单层模型，给予ReFerm?处理后同上检测WB与免疫荧光；（5）酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）及酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA）检测血浆TNF与血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Polypeptide, VIP）。
3.1 Questionnaires
ReFerm?组在Visceral Sensitivity Index（VSI，内脏敏感性指数）、Short Health Scale（SHS，简短健康量表）评分较基线显著改善（p<0.05），安慰剂组仅SHS改善；IBS严重程度评分系统（IBS-SSS）两组均无统计学显著差异。表明本概念验证研究未检测到明显临床症状差异。
3.2 Decreased Permeability in Biopsies Exposed to ReFerm?
将ReFerm?（1:20稀释）直接加入Ussing chamber黏膜侧，IBS结肠活检组织的旁细胞通透性（FITC-dextran 4 kDa Flux）与穿细胞通透性（HRP Flux）均显著低于Vehicle对照组（p<0.05）；1:100稀释无显著效应。TER与PD无显著变化，Isc显著升高。结论：ReFerm?在离体条件下可直接降低IBS结肠上皮旁细胞与穿细胞通透性，Isc升高反映氯离子分泌增强而非屏障受损。
3.3 Increased Expression of Tricellulin and Subcellular Enrichment at tTJ in Biopsies From IBS Patients Treated With ReFerm?
经14天ReFerm?灌肠后，WB显示活检中Tricellulin总蛋白表达较基线显著上调（p<0.05），Claudin-1、Occludin、ZO-1无变化；安慰剂组各TJ蛋白均无变化。共聚焦分析显示ReFerm?组tTJ处Tricellulin荧光强度与bTJ（bicellular tight junction，双细胞紧密连接）归一化比值及Tricellulin阳性三细胞顶点比例均显著高于基线（p<0.01），安慰剂组无变化。亚组分析示该效应主要由IBS-M亚型驱动。结论：ReFerm?灌肠可在蛋白总量及亚细胞定位双重水平提升tTJ处Tricellulin富集度，尤以IBS-M为著。
3.4 ReFerm? Stimulation in Caco-2 Cells Improves Subcellular Tricellulin Enrichment at tTJs
Caco-2细胞经ReFerm?（1:20）处理不同时间点，WB未检出TJ蛋白总表达量改变；共聚焦显示处理20 h与24 h后tTJ/bTJ Tricellulin强度比及阳性顶点百分比显著升高（p<0.05），与人体活检趋势一致。结论：ReFerm?可在无转录上调情况下促进Tricellulin向tTJ募集/锚定，提示其为翻译后定位调控。
3.5 Plasma VIP Levels Remained Unchanged Following ReFerm? Treatment, While TNF Levels Indicate a Protective Effect
血浆TNF在安慰剂组干预后轻度升高（p<0.05），ReFerm?组维持基线水平；VIP两组均无变化。结论：ReFerm?可抑制灌肠相关的轻度TNF升高，暗示其对局部低度炎症/黏膜免疫激活具稳定作用。
3.6 Relation Between Gut Findings and Clinical Data
年龄、BMI、病程及问卷评分变化与各屏障/TJ参数间无显著相关性，受样本量限制未能检出关联。
讨论部分指出：本研究首次在IBS患者离体与灌肠干预模型中证实发酵燕麦制品ReFerm?可通过上调Tricellulin表达及促进其向tTJ募集来降低旁细胞"漏途径（leak pathway）"通透性，并新发现其对穿细胞通透性的抑制作用。Isc升高伴TER不变及通透性下降，解释为ReFerm?诱导保护性氯离子分泌而非上皮损伤。Tricellulin总量小幅上升配合tTJ处明显富集，与既往文献中Tricellulin定位比总蛋白量更关键地决定旁细胞大分子泄漏相吻合。Caco-2模型中仅见定位改变未见总量上调，提示人体组织的总蛋白增加可能部分经由局部免疫/炎症微环境（如减少肥大细胞TNF释放）间接介导。血浆TNF在安慰剂组上升而在ReFerm?组被抑制，结合前期发现的肥大细胞脱颗粒减少，支持ReFerm?具轻度免疫调节/黏膜稳定作用。研究局限性含样本量小致亚组分析效力不足、灌肠局部高浓度不等同于口服后到达结肠之浓度、干预期较短（14天）、未完全解析ReFerm?中各活性组分（SCFAs、β-葡聚糖等）单独或协同贡献，且未观测到屏障改善与症状评分的直接关联。需更大样本口服给药临床试验验证临床疗效。
结论（Conclusions）
ReFerm?可增强IBS患者肠黏膜结肠屏障完整性——在离体直接应用时降低旁细胞与穿细胞通透性，在14天灌肠干预后上调Tricellulin表达并促进其向三细胞紧密连接（tTJ）亚细胞定位富集。该屏障保护作用提示以植物乳杆菌发酵燕麦所得的后生元制品可能通过调控Tricellulin发挥肠道屏障修复潜能，为IBS的营养干预策略提供机制依据。
