通过结构定义神经激肽选择性以改良NK2R（神经激 kinin 2受体）激动剂

《Nature Structural & Molecular Biology》：Structurally defining neurokinin selectivity to improve NK2R agonists

　　

基于胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和胃抑制多肽（GIP）受体的肠促胰岛素（Incretin）类肥胖药物治疗已革新了患者护理，但其作用主要通过减少摄食实现。能够增加能量消耗的方法可提升疗效，但仍难以实现。近期研究表明，神经激肽2受体（Neurokinin 2 Receptor, NK2R）激活在 preclinical模型中既可降低摄食又能刺激能量消耗。然而，内源性NK2R配体——神经激肽A（Neurokinin A, NKA）与其他受体家族成员存在交叉反应，后者与不良副作用相关。因此，理解NK2R选择性是解锁其治疗潜力的关键。本研究解析了NK2R分别与NKA及数种合成激动剂结合的冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）复合物结构，以发现驱动选择性的候选相互作用。随后通过靶向受体及配体突变分析，功能验证了NK2R结合口袋中的特定残基及合成肽激动剂C端对选择性负责的机制。这些发现为定义神经激肽选择性提供了结构框架，并有助于开发用于临床研究的改良NK2R激动剂。

论文解读：通过结构定义神经激肽选择性以改良NK2R激动剂

基于GLP-1R（Glucagon-Like Peptide-1 Receptor）和GIPR（Gastric Inhibitory Polypeptide Receptor）的肠促胰岛素疗法虽革新了肥胖与2型糖尿病（T2D）治疗，但主要通过抑制食欲减重，且存在恶心、在肥胖合并T2D患者中减重效果减弱及瘦体重流失等局限，亦无法提升能量消耗。增加能量消耗是改善体重维持的潜在策略，但既往尝试因安全性问题受阻。近期研究发现，长效NK2R（Neurokinin 2 Receptor，神经激肽2受体，属速激肽受体Tachykinin Receptor家族Class A GPCR）激活可在非厌恶状态下降低摄食并增加能量消耗（不改变心率），还能改善血脂及外周胰岛素敏感性，且无GLP-1R激动剂引起的胃排空延迟。然而内源性配体NKA（Neurokinin A）对NK1R（NK1R激活可致胃肠动力异常、支气管收缩、精神副作用）、NK3R均有高亲和力，缺乏亚型选择性阻碍了NK2R的临床转化。虽有选择性合成激动剂EB1002（NKA衍生的N端截短、氨基酸修饰并连接脂质延伸臂的七肽）报道，其选择性分子机制不明。本研究旨在通过解析NK2R–配体复合物高分辨率结构，阐明NK2R亚型选择性的结构基础，指导新一代抗代谢疾病NK2R激动剂设计。该论文发表于《Nature Structural & Molecular Biology》。

主要关键技术方法

研究人员构建NK2R–miniG_s/q70融合蛋白并与G_βγ及纳米抗体Nb35共纯化，制备NK2R与内源性配体NKA及四种合成激动剂（EB1001、EB1002、P336、P383）结合的Gq偶联活性态复合物，收集并解析2.8–3.4 ?分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构；通过定点突变技术构建NK2R/NK1R单位点与组合突变体，在Cos7细胞中分别采用基于BRET（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）的cAMP检测法与³H-myo-inositol积累的IP₃（Inositol Trisphosphate）累积法测定各配体对不同受体变体的效能（E_max）与半数有效浓度（EC₅₀），评估各化学修饰及受体残基对NK2R选择性的贡献。

Structural determination of NK2R bound by endogenous versus synthetic agonists（内源及合成激动剂结合NK2R的结构测定）

研究人员解析了NK2R与NKA及四种合成激动剂复合物的活性态cryo-EM结构，全局分辨率2.8–3.4 ?。比对发现各结构中跨膜（TM）区构象高度保守（RMSD < 0.8 ?），TM6胞内端外移约8.9 ?（相对于NK1R失活态），符合Class A GPCR激活特征；TM7内移不明显。配体识别诱导Y266^6.51向下位移，推动W263^6.48（Toggle Switch）移位及P^5.50I^3.40F^6.44连接器重排，最终致TM6外旋。结合口袋及配体相互作用残基密度清晰，为后续选择性分析奠定基础。

Structures of NK2R complexes with endogenous and synthetic agonists reveal selectivity drivers（NK2R–内源/合成激动剂复合物结构揭示选择性驱动因素）

通过比对NKA、EB1002及EB1001结合模式发现：EB1002第3位Tyr（Y3，对应NKA第6位Phe→Tyr置换）可与NK2R A94^2.65主链形成氢键并与F26^N-ter发生T型π堆积；EB1002第2位Lys（K2，Ser2Lys）与Y280^ECL3形成阳离子?π堆积，使N端羧基远离ECL2的K180^ECL2。C端Met→甲氧西宁（Methoxinine, Mox）使羰基氧与Q166^4.60、Y266^6.51形成新氢键。微小残基改变（如EB1001 Norleucine vs EB1002 Mox、N端Asp vs Glu、中间残基差异）可通过别构效应引起肽骨架全长的构象偏移，但四种合成肽均保持NK2R选择性，提示C端修饰及特定结合口袋残基是关键。

C-terminal ligand modifications are critical for NK2R selectivity（C端配体修饰对NK2R选择性至关重要）

功能验证显示：单独F3Y（Phe→Tyr）降低NK1R效价甚于NK2R，具选择性贡献；S2K（Ser→Lys）单独不显著影响选择性但联合F3Y提高两受体效力；L6主链N-甲基化及M7→Mox各自提升选择性，Mox贡献更大，二者叠加具累加效应；在此基础上加入S2K+F3Y进一步拉大两受体响应差距。脂质延伸臂影响配体在口袋中取向，使F3Y在无脂质时无选择性贡献而在EB1002中成为关键选择性元件，说明N端酰化/脂质化可调控结合模式。

Two deep binding-pocket residues are fully sufficient to confer NK2R selectivity（结合口袋深处两个残基足以赋予NK2R选择性）

NK2R与NK1R深口袋仅4个残基不同：NK2R为Y266^6.51、F267^6.54、F293^7.39、M117^3.36，对应NK1R为F264^6.51、Y269^6.54、M291^7.39、V116^3.36。单点突变不足以使NK1R被选择性激动剂激活，但NK1R双突变F264^6.51→Y / M291^7.39→F即足以使其被Memox-NKA及EB1002激活，表型模拟NK2R；反向NK2R Y266^6.51→F使信号显著下降。F267^6.54或V116^3.36/M117^3.36置换无特异性选择性影响甚至损害活化。因此Y^6.51与F^7.39是驱动NK2R选择性的核心口袋残基。

讨论与结论

研究人员通过解析NK2R–NKA及NK2R–选择性合成激动剂（EB1001、EB1002、P336、P383）的Gq偶联活性态cryo-EM结构（~2.8–3.4 ?），结合受体/配体位点突变与功能检测（IP₃累积及BRET-cAMP），阐明NK2R亚型选择性分子机制：配体N端截短后F3Y置换可通过氢键与π堆积稳定结合；S2K通过阳离子?π堆叠辅助定位；C端Leu主链N-甲基化干扰NK1R中潜在氢键，Met→Mox引入氧原子与NK2R特有Y266^6.51及Q166^4.60形成NK1R（F264^6.51）无法提供的氢键并被F293^7.39提供适宜空间/疏水环境，共同排斥NK1R结合。受体深口袋中Y266^6.51（对应NK1R F264^6.51）与F293^7.39（对应NK1R M291^7.39）的组合是区分NK2R与NK1R的关键，将NK1R中这两个残基突变为NK2R对应残基足以使NK1R被选择性NK2R激动剂激活。肽配体上微小残基变化可通过别构效应引起全长构象偏移。综上，C端修饰（主链甲基化+Met→Mox）协同NK2R特征残基Y^6.51与F^7.39是EB1002选择性的核心驱动因素，该结构框架可用于设计高选择性NK2R激动剂以治疗心血管疾病与代谢性疾病而不引发NK1R相关不良反应。