TCR模拟物双特异性纳米抗体T细胞衔接器靶向细胞内肿瘤抗原用于癌症免疫治疗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：TCR-mimic bispecific nanobody-based T cell engager targeting intracellular tumor antigens for cancer immunotherapy

　　

T细胞衔接器（TCE）免疫疗法已彻底革新癌症治疗格局；然而，其疗效仍受细胞内肿瘤抗原不可及的限制。常规双特异性T细胞衔接器通常由易聚集的单链可变片段（scFv）构建，存在结构不稳定及抗原范围局限于胞外靶点的问题。为克服这些关键局限，研究人员开展了一项概念验证研究，建立了一种模块化的双特异性VHH-VHH免疫治疗平台。具体而言，研究人员开发了一类首创的TCR模拟物双特异性纳米抗体（Nb）T细胞衔接器（TCRm Bi-NbTE）平台，该平台可同时结合T细胞表面的CD3ε及肿瘤特异性肽-MHC I类（pMHC I）复合物，以HLA-A2/WT1^126-134或HLA-A2/GPC3^144-152为代表。体外功能分析及体内研究表明，TCRm Bi-NbTE具有卓越的特异性，可有效诱导抗原限制性T细胞活化，并介导对pMHC I⁺肿瘤细胞的选择性杀伤，同时不损伤抗原阴性细胞。在多种小鼠异种移植模型中，包括细胞来源异种移植（CDX）和患者来源异种移植（PDX）模型，TCRm Bi-NbTE显著抑制肿瘤生长、延长生存期并增强T细胞浸润，且未出现治疗相关不良反应。通过以HLA限制性的方式将T细胞重定向至细胞内抗原，TCRm Bi-NbTE建立了一个模块化、可扩展且具临床转化前景的平台，适用于广泛实体瘤及血液恶性肿瘤的下一代癌症免疫治疗。

## 研究背景与问题

T细胞免疫疗法通过调动机体免疫系统清除恶性细胞，已彻底革新肿瘤治疗格局，其中多种策略正被研究以重定向T细胞识别肿瘤细胞。双特异性T细胞衔接器（BiTE?）是一种工程化抗体，可同时结合T细胞表面的CD3及肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAA），从而促进高效的T细胞介导的细胞毒性作用。Blinatumomab?作为首个获批用于B细胞恶性肿瘤的CD19/CD3 BiTE分子，已验证BiTE分子在血液肿瘤中的治疗潜力。尽管取得显著进展，常规单链可变片段（scFv）构建的BiTE结构存在结构不稳定、溶解度低及易聚集等问题，导致生产过程中的技术挑战并限制其临床转化。更为关键的是，BiTE分子主要靶向胞外TAA，而这类靶点仅占已知肿瘤特异性蛋白的不足30%，绝大多数肿瘤抗原为细胞内或分泌型蛋白，使得常规BiTE疗法鞭长莫及。

近年来，纳米抗体（Nbs，骆驼科动物重链抗体可变区VHH结构域）作为scFv的替代方案被引入T细胞衔接器工程化领域。纳米抗体具有分子量小、亲和力高、组织穿透性强及易于遗传工程化等优势，且能规避多链抗体中的VH-VL结构域错配问题，为下一代T细胞衔接器的多样化、可扩展工程化提供了可能。研究人员此前开发的纳米抗体基双特异性及三特异性T细胞衔接器平台在临床前模型中已展现出强效抗肿瘤活性，但其对细胞表面抗原的依赖限制了治疗适用范围，并因正常组织中的抗原表达而存在脱靶毒性风险。因此，为克服上述瓶颈、拓展可靶向肿瘤抗原谱，亟需创新免疫治疗策略以增强纳米抗体基T细胞衔接器的疗效。

大多数细胞内蛋白经蛋白酶体降解为肽段，以肽-MHC（pMHC）复合物形式呈递于主要组织相容性复合物（MHC）I类分子表面，由CD8⁺细胞毒性T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别以启动免疫应答。在经由pMHC呈递的肿瘤相关抗原中，Wilms肿瘤1（WT1）和Glypican-3（GPC3）因在某些实体瘤或血液恶性肿瘤中高表达、而在正常组织中表达极低，成为理想靶点。为利用这些细胞内抗原，TCR模拟物（TCRm）抗体被开发用于靶向以pMHC复合物形式呈递的细胞内抗原。研究人员所在团队此前已生成特异性识别HLA-A2/WT1^126-134和HLA-A2/GPC3^144-152复合物的TCRm纳米抗体，证明了选择性有效靶向的可行性。然而，TCRm疗法的疗效常受限于肿瘤细胞表面pMHC复合物较低的表位密度。早期ESK1-BiTE已在临床前研究中展现出肿瘤特异性细胞毒性潜力，凸显了将TCRm特异性整合入纳米抗体工程化T细胞衔接器框架的前景。

## 研究设计与技术方法

研究人员开展了一项概念验证研究，建立模块化双特异性VHH-VHH免疫治疗平台。该技术体系的核心要素包括：基于结构生物信息学的蛋白质同源建模（SWISS-MODEL平台）；大肠杆菌BL21(DE3)异源表达系统；Ni²⁺-NTA亲和层析纯化；SDS-PAGE及SEC-HPLC纯度鉴定；西方印迹分子验证；生物膜层干涉技术（BLI）亲和力测定；流式细胞术结合功能分析；基于sCRAP算法的交叉反应性预测；丙氨酸扫描突变定位关键识别残基；CFSE 5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯标记增殖实验；T细胞活化与记忆表型多色流式分析；ELISPOT酶联免疫斑点检测；基于7-AAD的活细胞/死细胞双色流式细胞毒性实验；NOD/SCID免疫缺陷小鼠CDX及PDX模型（样本队列来源：HLA分型健康供者外周血单个核细胞PBMCs，经广西医科大学伦理委员会批准；原发性肝细胞癌PDX模型组织来源于手术切除标本）；小动物活体生物发光成像；TUNEL末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP nick end labeling及Ki-67免疫组织化学；RNA测序及基因本体（GO）富集分析。

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研究结果部分围绕四个核心主题展开。**TCRm Bi-NbTE的设计与鉴定**：研究人员将先前筛选鉴定的抗CD3ε纳米抗体，通过柔性Gly₄Ser连接肽与靶向HLA-A2/WT1^126-134或HLA-A2/GPC3^144-152复合物的TCRm纳米抗体融合，构建新型TCRm Bi-NbTE分子。蛋白质同源建模预测了其空间构象。大肠杆菌表达优化显示，HLA-A2/WT1¹²⁶ TCRm Bi-NbTE在0.5 mM IPTG、37℃诱导6小时条件下产量最高，而HLA-A2/GPC3¹⁴⁴ TCRm Bi-NbTE在0.5 mM IPTG、16℃诱导16小时条件下表达最佳。两种蛋白经Ni²⁺-NTA亲和层析从包涵体中高效纯化，纯度经SDS-PAGE和SEC-HPLC确认超过90fabs Western blot验证。

**nlysis of the lengthy patient's facial and ocampic angle天然来源ренesch accents added sound effects were used to create these scenes together with other elements from different sources

研究人员系统表征了TCRm Bi-NbTE的结合特异性。HLA-A2/WT1¹²⁶ TCRm Bi-NbTE特异性结合OVCAR3（HLA-A2⁺/WT1⁺）细胞、T2-WT1^126-134脉冲细胞及原代人T细胞，对K562（HLA-A2^-/WT1⁺）细胞、无关肽脉冲T2细胞或未脉冲T2细胞无 detectable binding。类似地，HLA-A2/GPC3¹⁴⁴ TCRm Bi-NbTE特异性结合HepG2（HLA-A2⁺/GPC3⁺）细胞、T2-GPC3^144-152脉冲细胞及原代人T细胞，而对Huh-7（HLA-A2^-/GPC3⁺）细胞等无结合。竞争性抑制实验证实其结合特异性：可溶性重组hCD3ε蛋白预孵育显著降低TCRm Bi-NbTE结合。BLI测定亲和力显示，HLA-A2/WT1¹²⁶ TCRm Bi-NbTE对重组CD3ε的平衡解离常数（K_D）为2.49×10^-8 M，对HLA-A2/WT1^126-134复合物蛋白为5.39×10^-7 M；HLA-A2/GPC3¹⁴⁴ TCRm Bi-NbTE对CD3ε的K_D为1.18×10^-8 M，对HLA-A2/GPC3^144-152复合物蛋白为1.01×10^-7 M。夹心ELISA证实TCRm Bi-NbTE可同时结合两种靶抗原，无空间位阻。sCRAP算法预测的结构相似性分析结合实验验证表明，TCRm Bi-NbTE对预测的高排名同源肽无交叉反应性。丙氨酸扫描突变定位关键761-511。在HLA-A2/WT1¹²⁶ TCRm Bi-NbTE中，Arg1、Asn5、Ala6和Leu9为关键识别残基；HLA-A2/GPC3¹⁴⁴ TCRm Bi-NbTE中，Val2、Gly3、Phe5和Val9尤为重要。

**TCRm Bi-NbTE触发T细胞活化、增殖及效应功能**：与无关NbTE或空白对照相比，两种TCRm Bi-NbTE均诱导强劲的T细胞活化，表现为CD25和CD69 Surface expression显著上调，CD107a脱颗粒活性增强。TCRm Bi-NbTE处理组在pMHC⁺肿瘤共培养中介导大量T细胞增殖，而对照组细胞分裂 minimal。值得注意的是，TCRm Bi-NbTE促进向中央记忆T细胞（T_CM，CD45RA^-/CCR7⁺）的分化，该表型与增强的增殖潜能、淋巴归巢及再次遭遇抗原时的快速效应分化相关，提示持续抗肿瘤免疫的潜力。效应细胞因子IL-2和IFN-γ分泌显著升高，ELISPOT分析显示IFN-γ⁺ T细胞频率增加。重要的是，TCRm Bi-NbTE应用于HLA-A2⁺/抗原^-肿瘤细胞系（ARH77、SW480）或HLA-A2⁺健康供者正常CD34⁺细胞时，未观察到T cell activation，进一步支持TCRm Bi-NbTE触发强效抗原依赖性T细胞反应。

**TCRm Bi-NbTE介导对pMHC⁺肿瘤细胞的特异性细胞毒性**：在效应细胞与靶细胞比例（E:T）为10:1条件下，两种TCRm Bi-NbTE对多种HLA-A2⁺/GPC3⁺细胞（T2-GPC3^144-152、HepG2、原代HCC细胞）或HLA-A2⁺/WT1⁺细胞（T2-WT1^126-134、OVCAR3、OCIAML3细胞）均诱导强效、剂量依赖性的T细胞细胞毒性，显著优于无关NbTE或单独T细胞。对pMHC^-细胞（无关肽脉冲T2细胞、未脉冲T2细胞、K562、ARH77、Huh-7、SW480或Hela细胞）无 appreciable lysis。细胞毒性呈E:T比例依赖性，在10:1时达最大杀伤，5:1时仍有显著杀伤。无T细胞存在时不发生杀伤，确证细胞毒性完全依赖于T细胞。TCRm Bi-NbTE较其抗TCRm Nb对应物显著更有效，凸显CD3结合在驱动高效杀伤中的关键作用。

**TCRm Bi-NbTE在人造血小鼠模型中展现 robust 抗肿瘤疗效**：在HepG2-Luc和OVCAR3细胞来源的CDX模型中，TCRm Bi-NbTE治疗相比对照组显著抑制肿瘤生长，并在体生物发光成像评估中得到证实，同时赋予显著生存获益。在原发性人HCC组织建立的PDX模型中，TCRm Bi-NbTE治疗同样显著抑制肿瘤生长并延长生存。未观察到显著体重下降或治疗相关毒性迹象，ALT、AST及IL-6、IL-1β等促炎细胞因子水平稳定。组织学分析显示， episode Ki-67⁺增殖细胞减少、凋亡细胞增加。流式分析揭示TCRm Bi-NbTE治疗组肿瘤和脾脏中CD3⁺ T cell infiltration增强，外周血CD3⁺ T细胞计数在给药后两周内 sustained at elevated levels。转录组分析显示，TCRm Bi-NbTE治疗上调广泛的T细胞活性 signature，包括谱系标志物（CD3E、CD8A、CD4）、活化标志物（IL2RA、CD69）、细胞毒性效应分子（GzmB、GzmA、PRF1、FASLG）；耗竭标志物（PDCD1、CTLA4、HAVCR2、LAG3、TIGIT）呈中度升高，与持续活化信号伴随 robust 效应反应一致。GO富集分析显示T cell proliferation、activation、mediated cytotoxicity及immunity、proinflammatory cytokine signaling等通路显著富集。

## 讨论总结与研究结论

TCRm Bi-NbTE的开发旨在克服现有T细胞衔接器免疫疗法的局限性，特别是针对细胞内致癌蛋白驱动的恶性肿瘤。该研究首次将TCRm纳米抗体特异性整合入全纳米抗体T细胞衔接器框架，引入了一类首创的TCRm双特异性纳米抗体T细胞衔接器，同期靶向CD3ε和肿瘤相关pMHC复合物（HLA-A2/WT1^126-134或HLA-A2/GPC3^144-152）。研究发现，TCRm Bi-NbTE能够强效重定向T细胞，诱导robust、抗原限制性的活化和细胞毒性，同时保护pMHC^-细胞，代表了TCE设计理念的概念性突破。

TCRm Bi-NbTE与传统scFv基TCE的关键区别在于其结构及生物物理学特性。常规scFv构建体常受困于易聚集的结构和欠佳的组织穿透；而TCRm Bi-NbTE利用骆驼科来源纳米抗体，具备分子量小、稳定性 exceptional、肿瘤穿透增强的优势。此外，TCRm Bi-NbTE克服了ImmTAC、ESK1-BiTE或TCR融合蛋白等既往双特异性格式的关键挑战：通过以纳米抗体替代scFv，规避了VH-VL结构域错配导致的结构不稳定性，便于原核系统高效生产，并确保即使在相对低的pMHC密度下仍能有效介导T细胞-肿瘤细胞结合。ESK1主要通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）介导肿瘤杀伤，而TCRm Bi-NbTE驱动直接的抗原依赖性T细胞细胞毒性，提供根本不同的作用机制。该双特异性VHH-VHH工程平台可 readily 重定向至其他细胞内抗原和新抗原，建立模块 unique 平台以释放T细胞介导的抗肿瘤免疫。

纳米抗体支架因有利的亲和力和生产可扩展性而具有显著的临床应用潜力。 leveraging 此前表征的抗CD3ε Nb、HLA-A2/WT1^126-134 TCRm Nb和HLA-A2/GPC3^144-152 TCRm Nb，研究人员成功生产出具备有利结合动力学的功能性TCRm Bi-NbTE分子。TCRm Bi-NbTE表现出严格的特异性，仅在体外驱动抗原匹配靶点的T细胞增殖、活化、细胞因子分泌和细胞毒性，提示其作为单药或联合其他 consenting 免疫治疗的应用前景。重要的是，TCRm Bi-NbTE在PDX和CDX模型中有效抑制肿瘤、延长生存，伴随瘤内T细胞浸润增加及T细胞活化与细胞毒性的转录特征，定位为生产流程更简化的临床转化候选药物。

TCRm Bi-NbTE最引人注目的特性在于其靶向pMHC复合物呈递的细胞内肿瘤抗原的能力，将可靶向空间扩展至新抗原和共享细胞内致癌蛋白。虽然直接靶向表面GPC3确实可行，但pMHC中心的策略提供了 distinct 且互补的优势，具有潜在的 superior 肿瘤特异性并避免可溶性GPC3抗原干扰。与需要复杂制造且存在细胞因子释放综合征风险的自体CAR-T细胞疗法不同，TCRm Bi-NbTE代表一种"现成可及"、药理学可处理的模态，其模块化设计实现向其他新兴pMHC复合物的快速重靶向。该策略并非取代而是补充直接蛋白靶向，是 prioritizing 肿瘤选择性的战略选择，作为潜在通用平台的概念验证，能够靶向广泛的细胞内肿瘤抗原库，适用于多种肿瘤类型，从而解决当前TCE免疫治疗的主要局限。

研究局限性包括：采用免疫缺陷小鼠模型，可能无法完全重现人类肿瘤-免疫相互作用；虽在模型中未观察到治疗相关严重不良反应，但全面的on-target/off-tumor毒性及免疫原性评估仍需未来在人源化免疫模型或非人灵长类中开展；转录组数据揭示的T细胞效应通路上游调控因子需进一步机制阐明；特异性分子相互作用有待结构研究解析。为改善患者便利性和治疗依从性，正通过融合抗人血清白蛋白（HSA）纳米抗体开发半衰期延长格式，有望显著改善药代动力学特性。尽管纳米抗体通常免疫原性低，人源化策略对临床翻译仍属 essential。此外，与CAR-T细胞治疗、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂的联合策略值得探索以协同增效。

**研究结论**：通过协同纳米抗体基T细胞衔接器的精确性与TCRm纳米抗体的生物物理学优势，TCRm Bi-NbTE克服了常规TCE的结构和功能局限，实现以高 potency 特异性重定向T细胞对抗细胞内肿瘤抗原。该研究不仅验证了一种新型治疗策略，更提供了一个靶向细胞内致癌蛋白的通用、模块化且可扩展的工程平台，为癌症免疫治疗的更广泛临床应用奠定基础。