核凋亡介导蛋白毒性应激下的细胞死亡与神经退行性变

《Nature Communications》：Karyoptosis mediates cell death and neurodegeneration upon proteotoxic stress

　　

神经退行性疾病常与疾病特异性蛋白相关的蛋白毒性应激有关。自噬-溶酶体系统对蛋白毒性应激提供关键调控，其功能障碍可引发细胞凋亡。然而，在衰老和神经退行性疾病中，凋亡不足以解释所有神经元死亡，已有报道在这些背景下存在多种不同的细胞死亡类型。本研究显示，核凋亡（一种独特的细胞死亡形式）可由蛋白毒性应激诱导，并通过核退化和核物质胞外排出而发展。研究人员证实，核凋亡受p38激酶信号通路调控，该通路通过直接磷酸化控制核膜蛋白LaminB1的稳定性。研究人员在肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆（ALS/FTD）病理模型中发现核凋亡影响神经元。最后，在FTD和阿尔茨海默病（AD）患者的尸检额叶皮层中鉴定出核凋亡特征。这些发现共同揭示了一种与蛋白毒性应激和核膜稳定性直接相关的细胞死亡形式，该形式与神经退行性变相关联。

神经退行性疾病是老龄化社会面临的重大健康挑战，其核心病理特征之一是蛋白稳态失衡导致的蛋白毒性应激。神经元作为终末分化细胞，高度依赖自噬-溶酶体等蛋白质量控制途径维持长期生存。当自噬-溶酶体系统功能受损时，错误折叠蛋白聚集体会累积，引发蛋白毒性应激，最终导致神经元死亡。然而，传统上认为的细胞凋亡在神经退行性病变中并非唯一的死亡方式，许多神经元死亡缺乏典型的凋亡特征，这提示存在其他尚未阐明的细胞死亡机制。因此，揭示神经退行性病变中非凋亡性细胞死亡的具体形式及其分子调控机制，对于理解疾病进程和开发靶向神经保护策略至关重要。

本研究发表于《Nature Communications》，旨在探究由自噬-溶酶体清除功能障碍引发的蛋白毒性应激所导致的神经元死亡机制。研究人员通过多种体外、体内模型及人脑组织分析，鉴定并系统阐述了一种新型的、非凋亡且非坏死的细胞死亡形式，并将其命名为“核凋亡”。研究证实，核凋亡的核心特征是核膜（特别是LaminB1蛋白）的稳定性破坏，导致细胞核形态异常、核物质通过胞外囊泡排出，最终引发细胞萎缩和死亡。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路通过直接磷酸化LaminB1，成为调控核膜稳定性和核凋亡进程的关键分子开关。该研究不仅将核凋亡与ALS/FTD、AD等人类神经退行性疾病的病理过程联系起来，还通过定量分析揭示了其在患者脑组织中显著的作用效应值，为针对该通路开发神经保护疗法提供了新的理论基础和潜在靶点。

为开展研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在细胞模型方面，使用巴弗洛霉素A1（BafA1）或亮抑酶肽（Leupeptin）慢性处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，或通过小干扰RNA（siRNA）敲低大鼠原代皮层神经元中的Syntaxin-17（STX17），以模拟自噬-溶酶体清除功能障碍。利用原子力显微镜（AFM）测量了细胞和核表面的弹性变化。通过连续超速离心分离并表征了细胞释放的胞外囊泡（EVs），并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质组学等手段分析了其大小、浓度及内容物。在果蝇模型中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了LaminB非磷酸化突变体（Lam^T413A），并与自噬相关基因Stx17突变体或C9ORF72基因重复扩增产生的二肽重复蛋白（DPRs）表达模型相结合，在体评估核凋亡表型及遗传互作。在人类疾病相关性验证中，使用了表达C9ORF72 DPRs的大鼠原代皮层神经元模型、人诱导多能干细胞（iPSC）来源的皮层神经元模型，并对来自额颞叶变性（FTLD）和AD患者的尸检额叶皮层组织进行了基于LaminB1免疫荧光形态学的单细胞聚类分析。

研究结果部分通过一系列实验逐步揭示了核凋亡的特征、机制及其在疾病中的意义。
* **自噬-溶酶体清除抑制引发核退化和核物质胞外排出**：研究人员发现，慢性抑制溶酶体自噬清除（使用BafA1或Leupeptin，或敲低STX17）可在SH-SY5Y细胞和大鼠原代皮层神经元中诱导LaminB1核膜蛋白形成胞质斑点、核形态不规则（圆形度降低）以及细胞萎缩。这些变化伴随自噬受体p62的积累，表明存在广泛的蛋白毒性应激。时间进程分析显示，胞质LaminB1斑点积累在应激后12小时达到峰值，早于明显的核形态异常和细胞萎缩。进一步研究发现，在BafA1处理的细胞培养基中，存在对Triton X-100敏感的胞外囊泡释放，其中高速离心（20,000 × g）获得的“20K”EV组分富含DNA、总蛋白以及LaminB1和p62。蛋白质组学分析证实，该组分在自噬清除受损的细胞中特异性富集组蛋白、核内不均一核糖核蛋白（hnRNPs）等多种核蛋白，表明核物质通过EV途径被主动排出细胞。
* **核退化由蛋白毒性应激引发，是一种独立的细胞死亡机制——核凋亡**：研究证实，蛋白毒性应激诱导的LaminB1核退化伴随总LaminB1蛋白水平降低，并最终导致DNA损伤（γH2AX焦点和TUNEL阳性）。然而，DNA损伤发生在核膜损伤关键参数变化之后，且化学诱导DNA损伤（依托泊苷处理）不足以引发LaminB1胞质斑点积累、核形态不规则或p62积累。虽然BafA1处理会激活部分衰老相关信号（如p53磷酸化、p21增加），但并未诱导p16表达、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性或特定衰老相关分泌表型（SASP）因子。重要的是，BafA1诱导的蛋白毒性应激并未激活典型的凋亡标志（如caspase-3活化、PARP-1切割），且caspase抑制剂不能改善核异常。同时，也未检测到坏死性凋亡标志（磷酸化MLKL）、铁死亡标志（脂质过氧化）或副凋亡（parthanatos）的证据。因此，研究人员将这种独特的、核损伤为首发表型的细胞死亡定义为“核凋亡”。研究还发现，环磷腺苷效应元件结合蛋白3（CREB3）的羧基末端片段过表达可独立诱导核凋亡，但其敲低并不能阻断BafA1诱导的核凋亡，表明存在多条通路可触发此过程。
* **p38 MAPK通路通过调控LaminB1稳定性来调节核凋亡**：药理抑制p38 MAPK可减轻BafA1诱导的LaminB1胞质斑点积累和核形态不规则，以及STX17敲低引起的DNA损伤，但不影响p62积累，表明p38 MAPK在耦联蛋白毒性应激与核膜病理中起关键作用。磷酸化蛋白质组学鉴定出LaminB1的Ser 391是p38α的直接磷酸化靶点。研究人员制备了针对该位点的磷酸化特异性抗体，发现核凋亡过程中，一个50 kDa的LaminB1片段磷酸化水平升高，且可被p38抑制所挽救。功能上，表达非磷酸化突变体LaminB1^S391A的人成纤维细胞在复制性衰老中表现出LaminB1蛋白水平下降的抗性。在果蝇中，对应的非磷酸化突变体LaminB^T413A能减缓年龄相关的LaminB水平下降，并能挽救Stx17突变体果蝇的存活缺陷、延长寿命并改善神经元核膜形态异常。
* **神经元在蛋白毒性应激介导的神经退行性疾病模型中发生核凋亡**：在C9ORF72 ALS/FTD疾病模型中，表达多脯氨酸-精氨酸（poly-PR）二肽重复蛋白的大鼠原代皮层神经元表现出明显的核凋亡特征，包括LaminB1胞质斑点、核形态异常和TUNEL阳性DNA损伤，且无caspase-3活化。在果蝇脑中诱导表达poly-PR或poly-GR DPRs也重现了核形态异常和DNA损伤，且这些表型与DPR核内包涵体的存在直接相关。重要的是，在果蝇脑中敲低p38α或p38β，或共表达非磷酸化LaminB^T413A突变体，能部分挽救poly-PR或poly-GR诱导的运动功能障碍、寿命缩短及核形态异常。在人iPSC来源的皮层神经元中，BafA1处理导致细胞数量减少和TDP-43核质比降低（ALS/FTD的病理标志），而p38 MAPK抑制能显著挽救这些表型。
* **核凋亡标志存在于神经退行性疾病患者脑组织中**：通过对FTLD和AD患者及对照的尸检额叶皮层进行LaminB1免疫荧光单细胞形态测量和k-means聚类分析，研究人员在无监督条件下识别出不同的神经元表型集群。分析发现，存在两个与核凋亡特征一致的神经元集群：一个集群（早期特征）表现为较高的胞质LaminB1斑点密度和较小的胞质面积；另一个集群（晚期特征）表现为极低的LaminB1核圆形度和胞质萎缩。与对照组相比，来自FTLD和AD病例的神经元在这两个核凋亡相关集群中显著富集。定量估算显示，在神经退行性疾病中，额外有18-20%的神经元退化可归因于核凋亡。

在讨论部分，研究人员总结了核凋亡作为一种由蛋白毒性应激（特别是核内蛋白毒性应激物）触发的独特细胞死亡机制，其核心过程是核膜（通过p38 MAPK磷酸化LaminB1调控）的稳定性破坏、核物质通过EV排出，最终导致核退化、DNA损伤和细胞死亡。尽管核凋亡与某些其他非凋亡性死亡形式存在特征重叠，但其分子调控通路有待进一步厘清。研究也指出了当前工作的局限性，例如体内事件完整时间线的重建、EV排放在死亡过程中的确切作用及其对周围组织的影响等尚需深入探究。尽管如此，核凋亡的鉴定对于痴呆等神经退行性疾病具有重要意义。理解不同细胞死亡形式对神经元丢失的定量贡献，将有助于精准制定神经保护治疗策略。本研究将p38 MAPK及其对LaminB1的磷酸化识别为潜在治疗靶点，阻断或延缓核凋亡可能成为延长神经元生存时间、扩大治疗窗口的关键策略。

研究结论指出：核凋亡是一种与蛋白毒性应激和核膜稳定性直接相关的细胞死亡形式，在神经退行性变中发挥作用。