常见人源ALDH1B1与ALDH2变异加重单次乙醇给药后小鼠神经炎症反应

《SCIENCE ADVANCES》：Common human ALDH1B1 and ALDH2 variants increase neuroinflammatory response to a single ethanol dose in mice

　　

不同于已有充分研究的乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2）低活性变异，低活性ALDH1B1（ALDH1B1）的影响尚未阐明。研究人员利用Global Human Genome Aggregation Database（gnomAD）鉴定出38个在不同人类遗传祖先群中常见（等位基因频率＞0.1%）的ALDH1B1变异。部分错义ALDH1B1人源变异酶活性及稳定性明显降低，3个变异因提前终止密码子导致完全功能缺失（loss of function, LoF）。鉴于这些失活变异在人类中常见，研究人员研究了小鼠同时携带ALDH1B1 LoF与ALDH2失活变异的影响。携带ALDH1B1G193fs与ALDH2 * 2E504K的双敲入（double knock-in, DKI）小鼠表现出升高的神经损伤标志物。单次乙醇灌胃（2 g/kg）后，与野生型（wild type, WT）或单突变小鼠相比，DKI小鼠醉酒表现加重，且神经损伤标志物水平显著升高，包括升高的β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）及磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau, ptau）217。本研究提示常见低活性线粒体ALDH酶——尤其是饮酒人群中——对人类健康的潜在影响。

论文解读：常见人源ALDH1B1与ALDH2变异加重单次乙醇给药后小鼠神经炎症反应

本文发表于《SCIENCE ADVANCES》。乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）超家族负责代谢外源与内源性醛类，包括乙醇代谢毒性副产物乙醛及脂质过氧化产物如4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）。人基因组含19个功能性ALDH基因，其中ALDH2位于线粒体基质，其E504K（ALDH2 * 2，rs671）失活变异在东亚人群高发，与癌症及慢性退行性疾病风险增加相关。ALDH1B1与ALDH2氨基酸序列同源性达72%，同为线粒体内同源四聚体，由ALDH2基因复制而来且无内含子，是继ALDH2之后第二高效的乙醛氧化酶（Km＝55 μM）。既往对ALDH1B1常见变异（如A86V、R107L等）的功能及其与ALDH2联合缺陷的生理病理影响知之甚少。由于脑组织对氧化应激及毒性醛负荷高度敏感，ALDH介导的醛解毒能力下降可能诱发神经炎症及阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）相关病理改变。因此，本研究旨在明确常见低活性ALDH1B1变异单独及联合ALDH2 * 2变异对乙醇暴露后小鼠脑线粒体功能、神经炎症及AD相关生物标志物的影响。

主要关键技术方法：

研究人员基于gnomAD 4.1.0数据库筛选ALDH1B1及ALDH2常见变异（等位基因频率＞0.1%），利用灵长类比对确定参考序列（reference sequence, RS）；原核表达并纯化人ALDH1B1各变异重组蛋白，测定乙醛为底物的酶促活性及环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）处理下的蛋白稳定性；利用CRISPR/Cas9构建小鼠Aldh1b1^G193fs（模拟人ALDH1B1无义突变LoF）敲入（knock-in, KI）小鼠，并与已建立ALDH2^E504KKI小鼠交配获得双敲入（DKI）小鼠；取5月龄雄性小鼠脑组织及血清，Western blot检测线粒体动力学、神经炎症及AD相关蛋白，ProcartaPlex法检测细胞因子谱，ELISA检测血清神经丝轻链（neurofilament light chain, NFL）；单次乙醇（2 g/kg）灌胃后观察7小时直立（rearing）行为，并于4小时取材检测神经损伤及炎症指标。

研究结果

The frequency of common ALDH1B1 and ALDH2 variants in different human ancestry groups

gnomAD 4.1.0筛选出38个常见ALDH1B1变异，重点关注5个错义变异（A86V、R107L、V176I、M253V、V470A）及2个移码LoF（G193VfsTer16、G388EfsTer23）。全球约25%东亚人同时携带ALDH2 E504K及ALDH1B1常见错义变异（A86V或R107L）之一，提示相当比例人群存在双重乙醛代谢缺陷。

Common ALDH1B1 variants exhibit decreased protein stability and catalytic activity

原核表达及细胞稳定性实验表明：A86V、R107L、V176I特异活性较参考酶低20%–50%，M253V及V470A低＞65%；除A86V外，其余变异蛋白在CHX处理后降解加速、稳定性显著降低，证实常见ALDH1B1变异普遍存在酶活降低与稳定性下降。

Deficiency in both ALDH1B1 and ALDH2 results in increased phosphorylated proteins regulating mitochondria fission and signaling in mice

DKI小鼠脑内线粒体分裂因子（mitochondrial fission factor, MFF）及磷酸化动力蛋白相关蛋白1（phosphorylated dynamin-related protein 1, pDrp1^Ser616）显著升高，蛋白激酶Cδ（protein kinase C delta, PKCδ）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylated extracellular signal–regulated kinase, pERK）及周期蛋白B1（cyclin B1）上调，提示双重缺陷引起线粒体过度分裂相关信号通路激活及激酶异常活化。

Brains of DKI mice exhibit signs of increased inflammatory state

基础状态下DKI小鼠脑突触素（synaptophysin）降低，活化的星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）及小胶质细胞标志物离子钙结合适配器分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1, IBA-1）升高；CCL7、IL-18、IL-33、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）、CCL11上调，磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, pJNK）显著增加，显示基线神经炎症表型。

A single dose of ethanol results in prolonged intoxication behavior and exacerbated neuroinflammation in DKI mice

单次乙醇灌胃后DKI小鼠运动抑制持续时间最长（＞7小时未恢复），血清NFL显著升高；乙醇诱导DKI脑内CCL2及TNF-α大幅升高，4-HNE加合物累积增加；生理盐水组DKI即见Aβ及ptau^Ser217升高，乙醇处理后DKI脑Aβ、ptau^Ser217、Bax及活化的caspase-3较其他组进一步显著升高，证实单次中等剂量乙醇可加剧双重缺陷小鼠神经损伤、神经炎症及AD相关病理蛋白积聚。

讨论部分总结（研究结论翻译）：

ALDH1B1低活性或LoF常见变异在全球广泛分布，约四分之一东亚人同时携带ALDH2 E504K与ALDH1B1常见错义变异。单独ALDH1B1缺陷或联合ALDH2缺陷小鼠脑内出现线粒体动力学紊乱、基线神经炎症、tau过度磷酸化；单次乙醇暴露使双重缺陷小鼠运动障碍延长、轴突损伤标志物升高、促炎细胞因子及4-HNE加合物增加，并显著上调Aβ与ptau^Ser217等AD关联生物标志物。研究表明同时携带ALDH1B1与ALDH2功能缺陷的人群——尤其饮酒者——面临更高的神经炎症及相关神经退行性疾病潜在风险，未来需流行病学研究验证其与AD等疾病的关联。使用ALDH1B1选择性抑制剂于ALDH2活性低下个体需谨慎。本研究局限性包括仅使用雄性小鼠、未直接定量醛类累积、未评估长期慢性乙醇暴露及神经退行终末表型。