通过感觉-免疫相互作用调控中性粒细胞命运加速糖尿病性骨愈合

《Research》：Directing Neutrophil Fate via Sensory–Immune Interactions Accelerates Diabetic Bone Healing

　　

糖尿病性骨缺损的难愈性主要源于炎症反应的失调。尽管周围神经病变是一种常见的并发症，但感觉功能障碍是否在糖尿病失控性炎症中发挥作用尚不清楚。本研究在糖尿病性骨缺损内发现，感觉神经支配减少与免疫动态紊乱相关，其特征是中性粒细胞趋化性延迟和因巨噬细胞胞葬作用（efferocytosis）受损导致的中性粒细胞异常滞留。为此，研究人员设计了一种类似巧克力曲奇饼干的支架，其中表面嵌入的微球作为“芯片”实现白细胞介素-8（IL-8）的快速释放，而周围的丝素蛋白基质则提供神经生长因子（NGF）的持续释放。IL-8诱导的适时中性粒细胞趋化通过干细胞募集触发骨愈合，而感觉神经支配通过诱导中性粒细胞N2极化进一步强化了这一过程。值得注意的是，巨噬细胞优先与向外生长的神经突建立紧密的物理接近，形成类似突触的结构，在此处，神经元来源的半乳糖凝集素-3（Galectin-3， Gal-3）驱动巨噬细胞恢复胞葬作用。此外，时空调节神经免疫回路增强了糖尿病大鼠的下颌骨再生，突显了神经免疫相互作用在调控糖尿病炎症消退中的治疗潜力。

**糖尿病性骨愈合的神经免疫调控机制与治疗策略研究**

**研究背景与问题**
糖尿病（Diabetes Mellitus， DM）对全球公共卫生构成巨大负担，其并发症慢性难愈性创面严重影响患者生活质量，其中骨愈合障碍尤为棘手。生理性骨愈合包含炎症、骨再生和重塑等连续重叠的阶段。然而，在高血糖环境下，免疫细胞（尤其是中性粒细胞）的命运改变常导致炎症期停滞，无法顺利进入后续修复阶段。中性粒细胞与巨噬细胞在炎症期的时空相互作用被认为是推动愈合进程的“引擎”。在糖尿病状态下，大量失调的中性粒细胞和巨噬细胞滞留在炎症期，严重阻碍伤口愈合。异常的中性粒细胞募集和中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Trap， NET）的异常激活是其关键因素，但糖尿病如何导致中性粒细胞异常滞留的机制尚不清楚。巨噬细胞通过胞葬作用清除凋亡细胞是骨免疫稳态的关键步骤，而在持续高血糖水平下，巨噬细胞胞葬功能缺陷已被认为会导致胰岛、脂肪组织和骨骼肌等部位的炎症无法消退。此外，近半数糖尿病患者患有周围神经病变（Peripheral Neuropathy， PN），其特征是轴突变性、远端纤维丢失和节段性脱髓鞘。临床证据表明，PN的存在与糖尿病患者骨折风险显著升高密切相关，提示PN可能直接导致糖尿病性骨病。骨组织高度受神经支配，周围神经与骨之间的相互作用已成为近年研究热点，感觉神经在骨发育和修复的微环境中被证明发挥着不可或缺的作用。然而，连接PN与骨健康的理论基础仍不明确。另一个重要问题是感觉神经如何调节免疫反应。先前研究主要关注神经免疫调节所涉及的介质，而忽略了这种调节精确发生的方式。“神经-免疫突触”是免疫细胞与神经突之间用于功能和分子互连的特化接触区，已在交感神经元与脾T细胞之间被发现，随后也在神经突与肥大细胞之间发现了类似的功能结构。然而，骨微环境中是否涉及类似结构参与神经免疫调节的报道很少。

**研究目的与方法**
本研究旨在探索感觉神经支配是否能协调免疫动态，从而促进糖尿病状态下的骨愈合。研究人员基于对小鼠和患者骨组织的转录组分析以及体内动物实验，描绘了糖尿病骨缺损部位的时空炎症模式。受此启发，研究人员设计了一种基于数字光处理（Digital Light Processing, DLP）打印的仿生“巧克力曲奇饼干样”（Chocolate Chip Cookie-like, CCC）支架，通过仿生时空协调中性粒细胞趋化和感觉神经支配，重编程炎症性骨环境。具体而言，支架仿生时空递送白细胞介素-8（IL-8）和神经生长因子（NGF），分别激发急性中性粒细胞反应和持续的感觉神经向内生长，从而加速糖尿病性骨愈合。在机制上，IL-8以及感觉神经增强了中性粒细胞的N2极化，从而促进了干细胞的募集。此外，感觉神经元-巨噬细胞突触样连接通过Galectin-3（Gal-3）-Mer酪氨酸激酶（Mer Tyrosine Kinase， MerTk）轴重新激活胞葬作用，从而抑制过度炎症。

**关键技术方法**
本研究综合运用了生物信息学分析、动物模型、生物材料工程和多种细胞分子生物学技术。关键技术包括：1. 利用公共基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus， GEO）中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序数据，分析糖尿病骨组织和背根神经节（Dorsal Root Ganglion， DRG）的转录组变化。2. 建立高脂饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）诱导的II型糖尿病小鼠和大鼠模型，并构建股骨和下颌骨临界尺寸骨缺损模型。3. 采用微流控技术制备透明质酸甲基丙烯酸酯（Hyaluronic Acid Methacrylate， HAMA）微球，并利用DLP 3D打印技术构建负载IL-8微球和NGF丝素蛋白（Silk Fibroin Methacrylate， SilMA）基质的CCC支架，实现细胞因子的时序释放。4. 通过体外共培养体系、流式细胞术、免疫荧光、扫描/透射电子显微镜、酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量聚合酶链式反应（qPCR）等手段，深入探究神经免疫相互作用的细胞与分子机制。

**研究结果**
**1. 糖尿病骨缺损中感觉神经支配减少与免疫流紊乱相关**
对小鼠长骨细胞和DRG神经元的转录组分析显示，与正常饮食组相比，高脂饮食诱导的糖尿病小鼠中性粒细胞趋化性和激活受损，但中性粒细胞比例增加，表明糖尿病中性粒细胞存在激活和消退的双重障碍。巨噬细胞比例下降且吞噬功能受损，提示中性粒细胞滞留可能源于巨噬细胞胞葬功能失调。同时，高血糖下巨噬细胞和感觉神经元中突触相关活性下调，感觉神经元轴突发生受损及其对凋亡-胞葬作用的调节减少，进一步支持神经功能障碍与炎症消退缺陷之间的联系。体内实验证实，糖尿病小鼠骨缺损早期中性粒细胞浸润几乎缺失，随后逐渐发展为持续的中性粒细胞溢出，且巨噬细胞与中性粒细胞存在空间分离，表明糖尿病条件下巨噬细胞介导的清除功能受损。体外共培养实验也显示，高糖环境下巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬能力显著降低。此外，糖尿病骨缺损中感觉神经（CGRP⁺/PGP9.5⁺）支配受损。

**2. 适时恢复中性粒细胞趋化性和感觉神经支配促进间充质基质细胞募集**
为挽救糖尿病导致的时空炎症模式紊乱和神经退变，研究人员制备了微球暴露的CCC支架。IL-8负载于HAMA微球中用于快速释放和早期中性粒细胞浸润，NGF负载于SilMA基质中用于持续释放和神经生长。通过掺入透明质酸酶调节微球降解速度，优化IL-8释放动力学。体外迁移实验表明，支架提取物能有效促进中性粒细胞趋化。Transwell实验显示，NGF刺激的感觉神经元与中性粒细胞共培养可显著增强从糖尿病小鼠分离的间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）的募集。体内实验表明，负载IL-8的CCC支架显著增加了MSCs的比例，额外负载NGF进一步（虽统计学不显著）提高了MSC比例，并增加了N2极化中性粒细胞的比例。

**3. CCC支架释放的NGF增强感觉神经元介导的成骨作用**
通过间接共培养系统评估CCC支架对感觉神经支配骨愈合的促再生作用。结果显示，用含有NGF的支架处理的感觉神经元条件培养基培养的骨髓来源MSCs，在所有组中表现出最明显的成骨分化，碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节形成均增强。免疫荧光和qPCR分析进一步证实，负载NGF的CCC支架增强了感觉神经介导的成骨作用。

**4. 神经免疫突触样结构恢复巨噬细胞胞葬作用**
研究人员测试了CCC支架促进感觉神经支配是否能恢复巨噬细胞胞葬作用。体外共培养实验显示，NGF激活的感觉神经元显著改善了巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的胞葬。扫描电镜观察发现，NGF负载的支架诱导了显著的神经突生长，且巨噬细胞优先定位于神经元胞体和向外生长的神经突，形成膜-膜接触。透射电镜在接触部位观察到了典型的突触小泡和致密核心小泡。机制上，RT-PCR分析显示，NGF刺激仅显著上调了糖尿病DRG神经元中Gal-3的表达。免疫荧光和ELISA证实，NGF负载组显著增加了DRG神经元的神经突生长和Gal-3的产生与分泌。Gal-3作为MerTK受体的配体，促进胞葬作用。使用MerTK抑制剂UNC2541或siRNA敲低DRG神经元中的Gal-3，均减弱了感觉神经元诱导的巨噬细胞胞葬能力，证明了Gal-3/MerTK轴在此神经免疫相互作用中的重要性。此外，神经元诱导的胞葬作用也促进了巨噬细胞M2极化。转录组分析显示，条件培养基刺激增强了巨噬细胞中吞噬作用相关基因的表达，其中β-肌动蛋白（Actb）是关键枢纽基因，其转录受Gal-3/MerTK轴调控。

**5. CCC支架重编程下颌骨缺损的糖尿病炎症微环境**
对糖尿病患者牙槽骨转录组的再分析显示，中性粒细胞迁移和胞葬作用相关生物过程同样在糖尿病下颌骨中受到显著抑制。在糖尿病小鼠下颌骨缺损模型中，负载IL-8的支架在术后1天显著升高了急性炎症标志物Il-1β、Tnf-α和中性粒细胞标志物髓过氧化物酶（Myeloperoxidase， Mpo）的表达，表明有效的早期中性粒细胞浸润。术后7天，负载NGF的支架降低了Mpo表达，同时提高了抗炎细胞因子Il-10和M2巨噬细胞标志物巨噬细胞甘露糖受体（Macrophage Mannose Receptor， MMR）的表达。流式细胞术分析证实，IL-8/NGF共递送有效减弱了成熟中性粒细胞的积累，同时进一步增强了N2中性粒细胞群体，并显著增加了MSC浸润。

**6. CCC支架通过恢复中性粒细胞命运和神经免疫界面增强大鼠骨愈合**
在糖尿病大鼠下颌骨临界尺寸缺损模型中，术后5天，负载IL-8的支架在损伤部位诱导了明显的中性粒细胞流入。术后8周，Micro-CT和组织学分析显示，双因子负载的“CCC”支架克服了单因子支架的局限性，实现了临界尺寸骨缺损的完全修复。免疫荧光分析显示，NGF递送不仅显著增加了缺损边界原生骨内的神经纤维密度，还导致新生骨组织内广泛的神经向内生长。在NGF负载的CCC支架诱导的新生骨边缘，重新建立了类似内源性神经免疫界面的突触样相互作用。此外，NGF负载的支架在糖尿病骨愈合期间显著增强了缺损区域内的血管生成。

**讨论与结论**
本研究整合了糖尿病小鼠和患者的转录组谱分析与动物模型，描绘了糖尿病骨愈合过程中改变的中性粒细胞命运，其特征是延迟但持续的中性粒细胞浸润，以及受损的巨噬细胞胞葬作用。值得注意的是，早期中性粒细胞浸润不足也损害了干细胞迁移，导致骨愈合延迟。此外，发现感觉神经支配减少与这种失调的中性粒细胞炎症有关。为利用这种紊乱的免疫反应，研究人员开发了一种DLP打印的仿生支架，通过恢复神经免疫串扰而具备仿生时空免疫调节能力。随后的体外和体内结果突出了神经免疫相互作用在协调骨愈合过程中的重要性：一方面，感觉神经支配促进了中性粒细胞的N2极化，促进干细胞募集以启动骨再生；另一方面，感觉神经元通过突触样结构分泌Gal-3激活巨噬细胞上的MerTK受体，从而恢复巨噬细胞的胞葬作用以解决 prolonged 的中性粒细胞炎症。
炎症对于组织再生不可或缺，但失调的炎症会显著损害愈合。在糖尿病中，过度的中性粒细胞浸润和NETs的异常形成已被广泛认为是慢性难愈性创面的主要原因。然而，中性粒细胞向促再生命运的转变长期以来未被充分重视。本研究发现了糖尿病骨缺损早期中性粒细胞浸润的显著缺陷，这种急性免疫反应的早期缺陷显著损害了干细胞募集并延迟了骨修复的启动。重要的是，通过IL-8恢复适时的中性粒细胞浸润逆转了这些损伤，强调了急性中性粒细胞反应在组织再生中不可或缺的作用。值得注意的是，研究人员进一步发现感觉神经支配促进了中性粒细胞的N2极化，从而增强了其促再生能力并促进了干细胞募集。
凋亡中性粒细胞被促炎M1巨噬细胞吞噬，随后其向M2修复表型转变，是组织修复过程中炎症向再生转变的基本步骤。然而，在高血糖下，胞葬作用关键受体（如CD36和B类清道夫I型受体）的下调显著阻碍了M1巨噬细胞的吞噬活性，导致中性粒细胞炎症无法消退。通过调节胞葬作用，可以精确引导中性粒细胞命运向炎症消退方向发展，这为糖尿病伤口愈合提供了一个有前景的治疗途径。PN是最普遍的糖尿病并发症之一，但其对巨噬细胞胞葬作用的影响在很大程度上被忽视了。本研究确定了一个先前未被认识的神经免疫回路，该回路在糖尿病骨修复过程中调控巨噬细胞胞葬作用。体外和体内实验证明，感觉神经与巨噬细胞物理上建立了突触样接触。在这个神经免疫界面，神经元Gal-3与巨噬细胞中MerTK的相互作用重新激活了对中性粒细胞的吞噬作用。类似的神经免疫突触样结构已在脾脏和肿瘤微环境中被描述，但此前没有与骨微环境或胞葬作用的控制相关联。本研究结果提供了机制性证据，表明这种神经免疫突触样界面可能作为适时炎症消退的内源性机制。
本研究存在一些局限性。仅使用了雄性小鼠，未探索性别对神经免疫回路的潜在影响。此外，交感神经系统也在骨重塑中起关键作用，交感神经功能障碍对糖尿病骨免疫调节的影响值得进一步深入研究。
总之，受糖尿病骨缺损中中性粒细胞流入紊乱特征的启发，研究人员设计了一种具有序贯释放IL-8和NGF的CCC支架，以重建协调的神经免疫回路，从而改善糖尿病性骨愈合。研究结果强调了一种先前未被认识的机制，即感觉神经协调早期炎症消退和再生激活，为糖尿病相关愈合障碍提供了新的治疗机会。