《Microbiology Spectrum》：ELISA-based quantification of neuraminidase in commercial influenza vaccines using virus-derived reference antigens
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大多数市售流感灭活疫苗由含推荐毒株血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原的灭活病毒制备，但目前仅监测HA抗原含量，NA抗原含量、稳定性及其对效力的潜在贡献尚不清楚。研究人员通过将NA酶联免疫吸附试验(
大多数市售流感灭活疫苗由含推荐毒株血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原的灭活病毒制备，但目前仅监测HA抗原含量，NA抗原含量、稳定性及其对效力的潜在贡献尚不清楚。研究人员通过将NA酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)与经固定化NA活性位点亲和色谱(Immobilized NA Active site Affinity Chromatography, INAAC)从鸡胚传代疫苗株(H1N1、H3N2及B型)中分离的NA参比抗原偶联，对两个流行季市售疫苗中的功能性NA含量进行了定量。结果表明，2024–25流行季未过期鸡胚基质疫苗含有预期三种NA，细胞基质疫苗可能需使用细胞传代NA参比抗原；鸡胚基质疫苗中NA含量因毒株和厂商而异，范围为0.7–1.7 μg/剂，NA:HA比为1:10–1:20。研究人员通过NA酶活性分析验证了ELISA结果，表明测得为功能性NA含量。2022–23流行季过期鸡胚基质疫苗中部分NA含量低或检测不到，提示随时间的构象完整性衰减。上述发现为定量疫苗中NA含量及稳定性、评估NA对效力的潜在贡献及优化含HA和NA的未来流感疫苗设计奠定了基础。
论文解读：《基于病毒源参比抗原ELISA定量市售流感疫苗中神经氨酸酶(NA)含量》
本研究发表于Microbiology Spectrum。目前季节性流感灭活疫苗虽含流感病毒表面血凝素(hemagglutinin, HA)与神经氨酸酶(neuraminidase, NA)两种抗原，且抗NA抗体具保护作用并可提供异亚型交叉保护，但现行药典/放行标准仅要求定量与控制HA含量，缺乏合适的NA参比标准品及可靠的功能性NA定量方法，导致疫苗中NA真实含量、NA:HA比例、批间差异及储存稳定性均不明确，也限制了NA补充策略的评估。为此，研究人员开发并应用了以病毒源NA参比抗原(viral NA, vNA)为标准的稳定性指示(stability-indicating)sandwich ELISA，结合固定化NA活性位点亲和色谱(Immobilized NA Active site Affinity Chromatography, INAAC)自鸡胚传代疫苗病毒中直接分离有酶活性的天然vNA作为定量参比，对2022–23及2024–25流行季市售鸡胚基质与细胞基质三价/四价灭活流感疫苗进行NA(N1、N2及B型NB)定量，并以MUNANA荧光酶活性法正交验证，考察未过期与过期疫苗中NA含量及降解情况，明确现有疫苗中功能性NA的实际水平。
主要关键技术方法如下：①利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统于Sf9昆虫细胞中表达并纯化重组全长NA(recombinant full-length NA, rfNA)与重组可溶性NA(recombinant soluble NA, rsNA)，用于ELISA条件摸索与特异性、拓扑偏差(topology bias)评价；②采用INAAC自鸡胚增殖的WHO推荐疫苗毒株全病毒裂解液中亲和纯化天然有活性的vNA，经还原/非还原SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography, SEC)及MUNANA底物测定酶比活性(specific activity)进行表征；③建立N1/N2/NB特异的sandwich ELISA——捕获用通用活性位点结合单抗FNI?9或其N2高亲和力突变体FNI?9/R27D，检测用对应NA型特异性HRP标记单抗(5D11、48G11及NDS.1)，并用vNA绘制四参数逻辑(4?parameter logistic, 4?PL)标准曲线定量疫苗样品中各NA；④以MUNANA荧光法测疫苗及各vNA混合物的NA酶活性，与ELISA定量结果比对验证功能性NA的检测能力；所用市售疫苗样品为2022–23及2024–25流行季鸡胚基质(Fluzone、Flulaval)与细胞基质(Flucelvax)灭活流感疫苗各一批。
RESULTS
研究人员首先表达并纯化rfNA与rsNA，经SDS?PAGE确认分子量(~58–68 kDa)、SEC示rfNA在去垢剂中存在高聚体(>670 kDa)，rsNA为四聚体及多聚体混杂；rfNA比活性高于rsNA，且稀释后4℃放置24 h rfNA活性保持稳定而rsNA活性大幅丧失，故后续以rfNA建立ELISA。构建的三种sandwich ELISA可特异性识别对应rfNA，混合rfNA信号与单独rfNA重叠度高；拓扑偏差测试显示N1 ELISA对rfNA/rsNA无偏差，NB与N2 ELISA存在轻微偏差但不影响定量；经70℃加热使rfNA失活后ELISA信号消失，证实方法可指示构象完整性。INAAC自2022–23流行季鸡胚疫苗株纯化的vNA在还原SDS?PAGE呈预期条带(B型NA出现疑似茎部蛋白酶切的头部域条带)，非还原条件下H1N1与H3N2 NA示二硫键连接的二聚体及SDS抗性四聚体，B型NA以单体/二聚体为主；三者均有MUNANA水解活性(H3N2＞B＞H1N1)。将此vNA作参比分析2022–23过期鸡胚疫苗，N1与NB ELISA可给出与vNA平行的信号并算出约1.6–1.7 μg/剂的N1/NB，但两产品N2 ELISA信号极低或无平行段，提示过期疫苗中部分NA已降解至检测限以下或构象破坏。进一步分析2024–25未过期疫苗并用同期INAAC分离的对应vNA(vN1/Vic22、vN2/Thai22、vNB/Aus21)作参比，所有未过期鸡胚疫苗在三型NA ELISA中均产生与vNA平行的剂量?反应曲线，细胞基质疫苗信号偏低且平行度差(可能源于鸡胚vNA与细胞源NA差异)；鸡胚疫苗各NA含量为N1 0.97–1.67 μg/剂、N2 0.74–1.72 μg/剂、NB 0.90–1.67 μg/剂，不同厂商同型NA相差可达约2倍；按ELISA测得浓度配制vNA混合物的酶活性与对应疫苗酶活性相符(偏差≤33%)，确证ELISA定量反映功能性NA。
DISCUSSION(讨论与结论翻译)
灭活流感病毒疫苗90%以上含推荐毒株HA与NA抗原，但仅监测HA含量。本研究通过将sandwich ELISA与INAAC自鸡胚疫苗病毒分离的vNA参比抗原偶联，测定了市售疫苗中功能性NA含量。未过期鸡胚基质疫苗可检出三种疫苗株NA，过期鸡胚疫苗中部分NA低或检不出提示NA可随时间衰减；未过期疫苗中功能性NA为0.7–1.7 μg/剂(约为HA的5%–10%)，NA:HA比约1:10–1:20，结果与NA酶活性分析一致，表明测得为具酶活性的NA。本方法为疫苗中NA含量及稳定性定量奠定基础，提示现有疫苗中NA抗原可能贡献抗体应答与保护。未来需完善vNA参比品的表征(纯度、溶液中粒径、功能分数)并注意细胞基质疫苗宜用细胞传代vNA作参比；各厂商NA含量差异提示NA补充策略需个性化；所选抗NA单抗需随流行株演变调整。综上，本研究所建方法可支持后续NA稳定性、批间一致性及NA含量?免疫原性关系研究，助力优化含HA与NA的流感疫苗设计。
