基孔肯雅病毒感染期间星形胶质细胞与神经元中I型干扰素（type I IFN）和PARP1激活的细胞类型依赖性诱导

《Microbiology Spectrum》：Cell type-dependent induction of type I interferon and PARP1 activation in astrocytes and neurons during chikungunya virus infection

　　

摘要：基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种蚊媒甲病毒（alphavirus），可引起发热、皮疹、关节炎及神经系统疾患。其非结构蛋白3（non-structural protein 3，nsP3）含有一个macrodomain（MD），是重要的神经毒力因子，可移除ADP-核糖基化（ADP-ribosylation，ADPr）底物上的二磷酸腺苷核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPr）。值得注意的是，CHIKV感染导致星形胶质细胞和神经元中呈现不同的ADP-ribosylation模式，且受nsP3 macrodomain介导的复制动力学调控。明确ADP-ribosylation与固有免疫激活（尤其是干扰素（interferon，IFN）释放）之间的联系，是阐明细胞免疫状态如何影响ADP-ribosylation（一种病毒感染中研究较少的翻译后修饰）的关键。本研究用CHIKV感染小鼠星形胶质细胞系C8-D1A和神经元细胞系NSC-34，检测固有免疫介质及I型IFN的转录和蛋白表达谱。通过PARP特异性抑制剂和基因敲低（knockdown）方法评估PARP1对全局ADP-ribosylation模式的作用。研究结果显示，神经元CHIKV感染通过caspase-3介导的凋亡驱动PARP1激活进而诱导ADP-ribosylation，且不伴随PARP家族基因的转录激活。与之相反，星形胶质细胞感染虽出现干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）编码的PARP（IFN-stimulated PARPs）转录激活，但ADP-ribosylation水平极低。神经元中固有免疫应答基因转录活性有限，而星形胶质细胞中模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）激活必需基因显著上调，从而增强双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）感知并提高感染期间I型IFN产生。研究人员认为，PARP1激活与I型IFN应答以细胞类型依赖的方式差异化调控CHIKV感染神经细胞中ADP-ribosylation的发生。

本文对发表于《Microbiology Spectrum》的研究论文《Cell type-dependent induction of type I interferon and PARP1 activation in astrocytes and neurons during chikungunya virus infection》进行解读总结。

基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）为蚊媒甲病毒（alphavirus），可致发热、关节炎及神经系统并发症如脑炎、吉兰—巴雷综合征等，近年亚洲基因型CHIKV相关严重神经后遗症报道增多。CHIKV的非结构蛋白3（non-structural protein 3，nsP3）含有macrodomain（MD），具结合和水解ADP-核糖（ADP-ribose，ADPr）能力，是神经毒力决定因子，也调控病毒RNA合成及免疫逃逸。前期研究发现CHIKV在脑内优先感染星形胶质细胞（astrocytes）而非神经元（neurons），且nsP3^MD突变影响两种细胞内子基因组RNA翻译及病毒复制，提示细胞类型依赖性感染动力学，但其对固有免疫应答的调控机制不明。此外，ADP-ribosylation（ADP-ribosylation，由ADP-ribosyltransferases／聚ADP-核糖聚合酶（poly(ADP-ribose) polymerase，PARP）家族介导）多数为I型IFN诱导的ISG产物，与抗病毒防御及细胞死亡相关，而CHIKV感染中枢神经细胞后的ADP-ribosylation特征及与固有免疫的关系尚未阐明。因此研究人员通过体外感染小鼠星形胶质细胞C8-D1A与运动神经元样细胞NSC-34，比较两种细胞CHIKV感染后的RIG-I样受体（RIG-I-like receptor，RLR）通路活化、I型IFN表达、IRF3（IFN regulatory factor 3）磷酸化核转位、PARP基因转录及全局ADP-ribosylation水平，并结合PARP抑制剂处理及PARP1 shRNA敲低实验，揭示细胞类型依赖性固有免疫激活模式及PARP1在神经元CHIKV感染中的作用。

主要关键技术方法：采用小鼠星形胶质细胞C8-D1A、小鼠神经元NSC-34细胞系及人星形胶质样CCF-STTG1、人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系进行CHIKV 181/25野生型（wild-type，WT）及nsP3^MD突变体（G32S、Y114A）感染；用poly(I:C)模拟dsRNA及外源I型IFN（universal type I IFN）处理作对照；通过RT-qPCR检测RLR／TLR／cGAS-STING通路基因、I型IFN（Ifna／Ifnb）、IRF（Irf3／Irf7）及PARP家族成员mRNA表达；ELISA定量上清IFNα／IFNβ蛋白；Western blot检测RIG-I、MDA5、MAVS、磷酸化IRF3（pIRF3）、IRF3、磷酸化IRF7（pIRF7）、IRF7、PARP1、cleaved caspase-3、pan-ADP-ribose及nsP3；细胞核质分离检测pIRF3核转位；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）检测nsP3与PARP1相互作用；PARP广谱及特异性抑制剂（413A、413B、ABT-888、Olaparib、PJ-34）处理观察病毒滴度变化；慢病毒shRNA敲低NSC-34中PARP1后检测病毒复制及ADP-ribosylation。

Retinoic acid inducible gene-I-like receptors are activated during chikungunya virus infection in astrocytes, but not neurons

用poly(I:C)、外源I型IFN及CHIKV感染分别处理C8-D1A与NSC-34细胞，Western blot及RT-qPCR显示poly(I:C)及外源I型IFN可上调星形胶质细胞RIG-I与MDA5，而神经元无响应；CHIKV感染仅上调星形胶质细胞RIG-I蛋白及Rigi、Mda5 mRNA（6 hpi显著上调，P＜0.0001），伴MAVS出现52 kDa剪切活化条带，神经元中RIG-I组成性表达但无感染诱导上调，MDA5及MAVS剪切均未见变化。结论：CHIKV感染激活星形胶质细胞而非神经元中RLR（RIG-I-MAVS）通路。

Type I interferon is expressed in astrocytes, but not neurons, during chikungunya virus infection and is influenced by the non-structural protein 3 macrodomain

RT-qPCR显示CHIKV感染星形胶质细胞Ifna与Ifnb mRNA显著上调（峰值24–36 hpi，P＜0.0001），神经元无I型IFN转录；ELISA证实C8-D1A及人CCF-STTG1上清可检出IFNα／IFNβ，SH-SY5Y神经元样细胞未检出。nsP3^MD突变体（G32S低ADPr结合／水解、Y114A高结合低水解）感染人星形胶质细胞较WT产生更高IFNα／IFNβ，且病毒滴度降低。结论：CHIKV诱导星形胶质细胞而非神经元产生I型IFN，该过程受nsP3^MD部分抑制。

CHIKV infection of astrocytes, but not neurons, induces IRF3 phosphorylation and subsequent nuclear translocation

CHIKV感染后星形胶质细胞IRF3出现分子量上移（磷酸化），pIRF3于24及36 hpi发生核转位，IRF7磷酸化亦在星形胶质细胞中升高；神经元中无pIRF3及pIRF7变化，核质分离证实神经元无pIRF3核转位。RT-qPCR示Irf3 mRNA仅在感染神经元上调，Irf7 mRNA在星形胶质细胞感染后上调。结论：CHIKV感染引起星形胶质细胞IRF3磷酸化及核转位从而启动I型IFN转录，神经元此通路不激活。

CHIKV infection of neurons, but not astrocytes, induces ADP-ribosylation

pan-ADP-ribose抗体Western blot显示CHIKV感染神经元全局ADP-ribosylation显著增强，星形胶质细胞无变化或略降；H₂O₂诱导氧化应激下星形胶质细胞ADP-ribosylation亦弱于神经元。RT-qPCR示星形胶质细胞感染上调IFN-stimulated PARPs（Parp9、Parp10、Parp13、Parp14、Parp12）转录（6 hpi达峰，P＜0.0001），神经元PARP家族基因（除人SH-SY5Y中PARP15外）均无显著调制。PARP抑制剂实验中，抑制PARP1／PARP2（ABT-888、Olaparib等）使星形胶质细胞内CHIKV滴度升高（PARP负调控病毒复制），而使神经元内CHIKV滴度降低（PARP1／PARP2正调控病毒复制）。结论：星形胶质细胞转录激活ISG-PARPs但不发生全局ADP-ribosylation；神经元不转录激活PARPs但通过其他机制发生PARP1依赖性强ADP-ribosylation，且PARP1促进神经元中CHIKV复制。

PARP1-mediated ADP-ribosylation during infection is critical for viral replication in neurons

CHIKV感染神经元出现caspase-3剪切活化（17 kDa片段）及PARP1剪切为89 kDa活性片段（24及36 hpi），星形胶质细胞中未见PARP1剪切及caspase-3活化。Co-IP显示nsP3与PARP1在两种细胞均可结合，但星形胶质细胞中PARP1–nsP3信号比高于神经元。shRNA敲低NSC-34中PARP1后，CHIKV滴度显著降低（24及36 hpi，P＜0.0001），全局ADP-ribosylation信号减弱，细胞存活率改善。结论：神经元CHIKV感染经caspase-3介导PARP1剪切激活，PARP1催化的ADP-ribosylation是病毒在神经元内有效复制所需。

讨论部分总结（结论翻译）

本研究阐明CHIKV感染引发细胞类型依赖性固有免疫应答：在星形胶质细胞中，CHIKV激活RIG-I、MAVS剪切、IRF3磷酸化及核转位，诱导I型IFN表达及ISG-PARP转录，但全局ADP-ribosylation受限，病毒高效复制最终致细胞死亡；nsP3^MD部分抑制星形胶质细胞I型IFN产生。在神经元中，RIG-I通路不激活且无I型IFN产生，感染触发caspase-3介导的PARP1剪切激活，引起强全局ADP-ribosylation，PARP1促进CHIKV复制并可能关联病毒持续感染。PARP1与nsP3在两种细胞均可互作，星形胶质细胞中互作更强。研究首次在分子层面揭示CHIKV神经毒力的细胞类型特异性固有免疫学基础，为理解脑部CHIKV感染致病机制及潜在药物靶点提供依据。局限性在于使用细胞系而非原代神经细胞，后续需在原代神经元及星形胶质细胞中验证。