《Bioorganic Chemistry》：Novel 2-indolinone benzylpiperidine- thiosemicarbazone hybrids as cholinesterase inhibitors: Design, synthesis and biological evaluation
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Zekiye ?eyma Sevin?li|?zge Soylu Eter|Gozde Hasbal-Celikok|Gulsum Altiparmak-Ulbegi|Ece Bay?r|Aylin ?endemir|Pinar Aksoy-Sagirli|Nilgün Kara
Zekiye ?eyma Sevin?li|?zge Soylu Eter|Gozde Hasbal-Celikok|Gulsum Altiparmak-Ulbegi|Ece Bay?r|Aylin ?endemir|Pinar Aksoy-Sagirli|Nilgün Karal?
土耳其凡城瓦恩大学药学院药物化学系，邮编65080，凡城，土耳其
摘要
本研究以多奈哌齐为设计基础，多奈哌齐是一种用于治疗阿尔茨海默病的选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，其结构包含1-吲丹酮环和苄基哌啶结构单元。为此，将1-吲丹酮环替换为2-吲哚啉酮环，并通过硫代半卡巴腙桥将苄基哌啶残基与2-吲哚啉酮环连接，从而设计出新的杂化化合物。基于计算机模拟研究结果，筛选出了29种新的2-吲哚啉酮苄基哌啶硫代半卡巴腙杂化化合物（10a-n和11a-o），并对其进行了合成。这些化合物的体外抗胆碱酯酶活性得到了测定，并与多奈哌齐进行了比较（AChE的IC50为0.44 μM，BuChE的IC50为4.70 μM）。化合物11e表现出最强的抑制作用（AChE的IC50为0.91 μM，BuChE的IC50为30.97 μM），而化合物11a、11b、11d、11g、11k、11l和11n也具有较强的AChE抑制活性（IC50范围为1.15–3.13 μM）。这些化合物对BuChE的抑制作用较弱或没有抑制作用。在HUVEC细胞系中评估了这些活性化合物的细胞毒性，发现化合物11b、11d、11e和11k没有细胞毒性作用。还在遭受H2O2损伤的SH-SY5Y细胞中研究了这些活性化合物及无细胞毒性化合物的神经保护作用。实验结果表明，化合物11e和11k在受损的SH-SY5Y细胞中具有显著的神经保护作用，其中11e的保护效果优于11k。此外，11e在血脑屏障模型中的渗透性明显更高。基于各项机制研究结果，11e被选为最佳候选化合物。还对11e的AChE结合位点进行了分子动力学模拟。
引言
阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，其特征为认知功能下降、记忆丧失、行为改变以及日常生活功能严重受损。它是老年人痴呆症的主要病因，也给社会经济带来了巨大挑战[1]、[2]、[3]、[4]。阿尔茨海默病的病理生理机制包括β-淀粉样蛋白斑块沉积、神经纤维缠结、神经炎症以及胆碱能神经元丢失，这些因素都会导致乙酰胆碱水平下降。此外，该疾病还伴有tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、金属元素平衡失调以及突触功能异常等现象[2]、[5]。乙酰胆碱在中枢和周围神经系统的神经传导过程中起着关键作用。除了阿尔茨海默病外，重症肌无力和青光眼也是由于乙酰胆碱或乙酰胆碱受体缺乏而引发的疾病。乙酰胆碱的水解会终止其突触功能，这一过程主要由两种胆碱酯酶催化：乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。在健康大脑中，乙酰胆碱酯酶是负责胆碱能调节的主要酶，而丁酰胆碱酯酶的作用相对较弱。因此，人们试图通过抑制乙酰胆碱酯酶来提升低水平的乙酰胆碱[6]、[7]。目前，阿尔茨海默病的治疗主要依靠多奈哌齐、利瓦斯蒂明、加兰他敏和他克林等已获批的胆碱酯酶抑制剂[8]、[9]，此外，多奈哌齐的衍生物氟佩齐的临床试验也正在进行中（见图1）[10]。
乙酰胆碱酯酶包含位于酶腔底部、负责催化功能的“催化活性位点”以及位于酶入口处的“外围阴离子位点”。多奈哌齐是一种含有苄基哌啶结构的选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂[11]、[12]。研究表明，多奈哌齐与乙酰胆碱酯酶结合后，分子中的苄基哌啶残基会与催化活性位点相互作用，而吲丹酮残基则与外围阴离子位点发生作用[13]、[14]、[15]。人们还设计了同时针对乙酰胆碱酯酶催化活性位点和外围阴离子位点的“双重抑制剂”。这类抑制剂不仅能通过与催化活性位点相互作用来增强胆碱能传导，还能通过与外围阴离子位点相互作用来阻止乙酰胆碱酯酶介导的毒性β-淀粉样蛋白纤维的形成。在设计双重抑制剂时，通常会使用中间连接链来确保乙酰胆碱酯酶的催化活性位点与外围阴离子位点之间保持合适的距离[16]、[17]、[18]、[19]。现有文献中有很多通过将多奈哌齐中的吲丹酮环替换为吲哚啉酮、香豆素或噻唑等其他环结构而得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂化合物[20]、[21]、[22]。
硫化氢是一种天然存在的气体，具有神经保护、抗氧化和抗炎作用，但在阿尔茨海默病等疾病中其浓度会下降。硫脲、硫酰胺和硫代氨基甲酸酯类物质可作为硫化氢的供体，被认为在神经退行性疾病的治疗中具有潜力[23]、[24]、[25]。有研究指出，硫代半卡巴腙结构可作为连接乙酰胆碱酯酶催化活性位点与外围阴离子位点的中间连接链[26]、[27]。1H-吲哚-2,3-二酮是一种天然存在的化合物，具有多种生物学和药理学活性，据信它是通过吲哚-2,3-二酮结合蛋白发挥作用的。最新研究显示，吲哚-2,3-二酮结构在防止β-淀粉样蛋白的毒性方面具有生物调节作用，还能通过吲哚-2,3-二酮结合蛋白选择性地影响蛋白质间的相互作用[28]、[29]、[30]。现有文献表明，基于吲哚-2,3-二酮的化合物在低剂量下就能显著抑制胆碱酯酶活性[5]、[20]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。
现有文献中有很多吲哚-2,3-二酮硫代半卡巴腙杂化化合物，它们具有多种生物学作用，包括抑制胆碱酯酶活性。这类杂化化合物通常是通过在硫代半卡巴腙残基的N4位置上添加烷基或苯基基团而获得的[31]、[32]、[36]、[37]。文献中还记载了多种杂化型胆碱酯酶抑制剂，这类抑制剂将多奈哌齐结构中的吲丹酮环替换为吲哚或香豆素等杂环结构，同时将苄基哌啶部分通过烷基或酰胺连接桥与其它结构相连[21]、[38]、[39]。不过，目前尚未有文献报道过通过硫代半卡巴腙桥将2-吲哚啉酮环与苄基哌啶残基连接起来的杂化化合物。在本研究中，研究人员首次将多奈哌齐中与外围阴离子位点相连的1-吲丹酮环替换为2-吲哚啉酮环，同时将对于催化活性位点至关重要的苄基哌啶残基通过硫代半卡巴腙中间连接桥与2-吲哚啉酮环相连。这样一来，通过在一个分子中结合两种不同的药效团，使其能够更牢固地结合到目标酶上，从而产生更强的抑制效果。此外，本研究还探讨了苄基哌啶残基与硫代半卡巴腙桥在3位和4位上的结合对抑制效果的影响。
在本研究中，研究人员设计并合成了1H-吲哚-2,3-二酮3-(4-(3/4-苄基哌啶基)硫代半卡巴腙)系列化合物（10a-n和11a-o）。所有合成化合物的结构都是通过光谱分析方法确定的。这些化合物的吸收、分布、代谢和排泄特性以及与乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的结合能力都是通过计算机模拟方法进行评估的。此外，这些化合物的抗胆碱酯酶活性、细胞毒性、神经保护作用以及血脑屏障穿透能力也在体外进行了测试（见图2）。
章节节选
QikProp应用分析结果
研究人员使用QikProp软件通过计算机模拟计算，预测了这些合成化合物的药代动力学性质，包括各种ADME参数。表1列出了化合物10a-n、11-o以及多奈哌齐的Lipinski五项规则符合情况，以及它们的部分物理化学和药代动力学特性。所有化合物在氢键供体数量和氢键受体数量方面都符合Lipinski五项规则的要求。根据该规则，
结论
多奈哌齐是一种含有1-吲丹酮环结构的重要药物，它对乙酰胆碱酯酶具有很强的抑制作用，因此被用于治疗阿尔茨海默病，但该药物也存在一些副作用。在本研究中，研究人员通过晶体学建模技术中的对接分析，将多奈哌齐中重要的药效团——1-吲丹酮环替换为2-吲哚啉酮环，从而设计了29种新的2-吲哚啉酮苄基哌啶硫代半卡巴腙杂化化合物，这些化合物属于3-BP和4-BP系列（10a–n和11a–o）。
分子对接
这些合成化合物是使用2D Sketcher软件绘制的，所有氢原子都被添加进去，随后在pH值为7.4的条件下，采用OPLS3e方法对化合物结构进行了能量最小化处理。之后，又使用LigPrep软件生成并保存了这些化合物的3D结构。研究人员还使用Qikprop软件对这些化合物的Lipinski五项规则符合情况以及部分物理化学和药代动力学特性进行了分析[59]。
所有与分子建模相关的操作都是通过
CRediT作者贡献说明
Zekiye ?eyma Sevin?li：文章撰写——审稿与编辑、文章撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目管理、研究方法设计、实验开展、资金筹集、正式数据分析、数据整理、研究概念构思。?zge Soylu Eter：文章撰写——审稿与编辑、文章撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、软件使用、研究方法设计、正式数据分析。Gozde Hasbal-Celikok：文章撰写——审稿与编辑、文章撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、研究方法设计、正式数据分析。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了土耳其科学与技术研究委员会（TüB?TAK）的资助（项目编号为3501-222S745）。
