硫唑[5,4-d]嘧啶与硫辛酸或邻苯二酚杂合化合物的设计、合成及药理学评价：新型A2A腺苷受体（A2A AR）拮抗剂在神经炎性疾病中的应用

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and pharmacological evaluation of thiazolo[5,4-d]pyrimidines hybridized with lipoic acid or catechol. Novel A2A adenosine receptor antagonists in neuroinflammatory diseases

　　

氧化应激与炎症是参与神经退行性疾病发病的两个密切相关过程。腺苷通过A2A受体亚型发挥其在炎症过程中的关键作用，使A2A腺苷受体（AR）拮抗剂成为有前景的治疗候选药物。在本研究中，研究人员设计并合成了三种硫唑[5,4-d]嘧啶衍生物，分别掺入抗氧化基团邻苯二酚（化合物1）和硫辛酸（化合物2和3），以获得兼具A2A AR拮抗活性与抗氧化活性的配体。所有化合物对人A2A AR（hA2A AR）均表现出纳摩尔级别亲和力及拮抗活性，其中化合物1还对A2B AR具有活性。在无细胞DPPH检测中，化合物1表现出显著的自由基清除活性。在脂多糖（LPS）刺激的小胶质细胞BV2细胞中，这些衍生物显著降低一氧化氮（NO）产生并改善小胶质细胞形态。此外，这些化合物增强抗炎细胞因子的释放。值得注意的是，化合物1显著降低细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化水平，表明其对细胞内炎症信号通路具有调控作用。总体而言，这些结果凸显了基于硫唑[5,4-d]嘧啶的杂合化合物作为抗炎A2A AR拮抗剂的潜力，支持对该系列化合物进行进一步研究，以开发治疗神经炎性疾病的新策略。

神经退行性疾病的发病机制中，炎症与神经退行性变密切相关。多发性硬化症（MS）等疾病的发生发展过程中，T淋巴细胞、B淋巴细胞和小胶质细胞等免疫细胞的激活，以及活性氧（ROS）、活性氮物种（RNS）、促炎细胞因子和抗体等炎症介质的释放，均发挥关键作用。研究表明，脱髓鞘病灶中T细胞和B细胞浸润密度与病灶活动性相关，提示在疾病早期针对炎症过程进行干预可能最为有效。腺苷作为内源性调节分子，通过四种G蛋白偶联受体（GPCR）——A1、A2A、A2B和A3腺苷受体（ARs）调控多种生理效应。其中A2A和A2B AR通过刺激腺苷酸环化酶增加环磷酸腺苷（cAMP）产生，而A1和A3 AR则产生抑制作用。A2A和A2B AR还能调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应，包括细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2），该通路在炎症基因表达、细胞因子产生和小胶质细胞激活中起核心作用。A2A AR拮抗剂SCH-58261在神经炎症模型中显示出抗炎效果，而A2B AR拮抗剂在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中也表现出临床症状改善作用。氧化应激是神经退行性疾病的另一关键危险因素，其与炎症过程相互促进。α-硫辛酸（LA）及其还原形式二氢硫辛酸（DHLA）具有强效抗氧化和抗炎活性，在EAE模型中可减少中枢神经系统免疫细胞浸润。基于神经退行性疾病的多因素特性，研究人员致力于设计兼具A2A AR拮抗活性和抗氧化效应的杂合化合物。此前报道的硫唑[5,4-d]嘧啶衍生物P686即为将高效A2A AR拮抗剂与抗氧化剂依达拉奉（EDA）杂合而成，该杂合策略基于结构-亲和力关系研究，即在骨架5位引入较大基团不影响A2A AR亲和力甚至可能增强选择性。

本研究中，研究人员以5-(3-甲氧基苄氨基)取代的硫唑[5,4-d]嘧啶衍生物A为母体，分别与抗氧化剂邻苯二酚和LA杂合得到化合物1和2，同时合成了化合物2的区域异构体3。三种杂合化合物均经过系统的药理学评价。研究人员首先评估了新衍生物1-5对人A1、A2A和A3 AR的结合亲和力，以及在hA2A和hA2B AR上的功能拮抗活性。结合亲和力检测采用放射性配体竞争结合实验，包括使用[³H]-DPCPX测定A1 AR亲和力、[3H]-ZM241385测定A2A AR亲和力、以及[¹²⁵I]-ABMECA测定A3 AR亲和力。功能活性通过cAMP检测实验评估，测定化合物抑制NECA诱导cAMP积累的半数抑制浓度（IC₅₀）。

结构-亲和力关系研究表明，含邻苯二酚环的噻唑并嘧啶1具有最高的hA2A AR亲和力（Ki = 10.1 nM），对A1和A3 AR的选择性分别为27倍和13倍，同时为强效hA2A AR拮抗剂（IC₅₀ = 22.7 nM），并对hA2B AR也有良好拮抗活性（IC₅₀ = 84.5 nM），成为双重hA2A/hA2B AR拮抗剂。LA杂合的噻唑并嘧啶2和3也表现出高hA2A AR亲和力，其中2（Ki = 16.4 nM）优于3（Ki = 39.8 nM）；两者均为hA2A AR拮抗剂，2（IC₅₀ = 34.1 nM）约为3（IC₅₀ = 101 nM）效力的3倍。分子模拟研究采用人A2A AR晶体结构（PDB代码：5NM4，分辨率1.7 ?），运用MOE软件的诱导契合对接和CCDC Gold软件进行分子对接分析。模拟结果显示，噻唑并嘧啶骨架位于受体腔中央，与胞外环2（EL2）的Phe168和Ile249^6.51相互作用；2位呋喃环指向结合腔深处，靠近Leu85^3.33、Trp243^6.48和His250^6.50；7位氨基与Asn253^6.55和Glu169形成极性相互作用；5位取代基指向胞外环境，可与TM1、TM2、TM7结构域及EL2、EL3的残基发生极性相互作用。对于2和3，尽管LA连接位置不同（间位或对位），但柔性链使其能与受体建立相似相互作用，这与其相近的亲和力数据一致。

抗氧化活性评价采用2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除实验，以抗坏血酸和没食子酸为阳性对照。结果显示，含邻苯二酚的化合物1表现出优异的自由基清除能力（EC₅₀ = 4.419 μM），优于两种阳性对照，而中间体4和5无活性。

在药理学研究方面，研究人员选用LPS刺激的BV2小胶质细胞作为神经炎症体外模型。首先通过结晶紫（CV）法和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴盐（MTT）法评估细胞活力和代谢活性，确定10 μM为后续实验的安全有效浓度。形态学分析显示，LPS刺激的BV2细胞面积增大、长宽比和周边长度增加、圆形度和实心度降低，呈现激活态的拉长不规则形态；而LA杂合物2和3以及LA本身可显著逆转这些病理形态改变，抑制小胶质细胞激活。

一氧化氮（NO）产生检测采用Griess法。杂合物1-3显著降低LPS诱导的NO产生，而单独使用的中间体4、5或LA无显著效果，提示抗氧化部分与A2A AR拮抗活性的协同贡献。Western Blot分析显示，化合物1-3处理对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达有轻微降低趋势，其中化合物1显著降低ERK磷酸化水平，表明其通过抑制MAPK/ERK信号通路发挥抗炎作用；而LA衍生物2和3对ERK无显著影响，提示A2B AR拮抗成分可能参与化合物1的增强活性。

细胞因子检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法。LPS刺激导致促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）增加，而抗炎细胞因子白介素-10（IL-10）水平不变。化合物1和2可显著增加细胞内IL-10水平，但未在培养基中检测到相应增加。化合物1还能显著降低细胞培养基中的IL-6水平。

氧化应激参数检测包括丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧阴离子（O₂^-）以及抗氧化酶过氧化氢酶（CAT）和总超氧化物歧化酶（tSOD）。结果显示，所测试化合物均未能显著降低MDA和O₂^-水平，也未能增加GSH水平或CAT、tSOD活性，反而表现出轻度促氧化效应。电子顺磁共振（EPR）实验采用5-(二乙氧基磷酰基)-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DEPMPO）自旋捕获技术检测短寿命自由基。结果显示，所有杂合物均降低羟自由基贡献，同时增加碳中心自由基比例，提示自由基种类的重新分布而非总体抑制。

血脑屏障（BBB）通透性采用体外平行人工膜通透性（PAMPA-BBB）实验预测。结果显示，化合物1（Pe = 4.6 × 10^-6 cm/s）和2（Pe = 6.3 × 10^-6 cm/s）可预测透过BBB（CNS+）。细胞摄取实验通过HPLC-MS/MS分析，显示化合物1-3在细胞裂解液中的信号强度明显高于培养基，表明其高效的细胞摄取和/或保留。

化学稳定性研究表明，化合物1-3在50 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中稳定。

综上所述，该研究成功设计并合成了三种新型硫唑[5,4-d]嘧啶-抗氧化剂杂合化合物。这些化合物作为强效选择性A2A AR拮抗剂，其中化合物1还具有A2B AR拮抗活性，能够有效抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，包括降低NO产生、改善细胞形态、增加IL-10产生以及抑制ERK磷酸化。化合物1和2具有良好的BBB通透性预测，且所有三种杂合物均能有效进入BV2细胞。尽管细胞内的抗氧化效应不如细胞外实验显著，但这些杂合化合物通过受体介导的抗炎通路和细胞内多重机制，展现出治疗神经炎性疾病如多发性硬化的潜力，其中化合物1因其双重A2A/A2的电子轨道拮抗活性和对ERK信号通路的显著抑制作用而成为最有前景的候选分子。该论文发表于《Bioorganic Chemistry》。